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Inmunoprecitación Hola a todos, este es el Dr. Vishal Trivedi del departamento de biociencia e ingeniería IIT Guwahati y lo que estábamos discutiendo, estábamos discutiendo sobre los diferentes tipos de herramientas inmunológicas, lo que se puede utilizar. Así que, en nuestras conferencias anteriores, hemos discutido acerca de cómo usted puede ser capaz de generar el policlonal, así como los anticuerpos monoclonales y luego subsecuentes a eso, estábamos discutiendo acerca de cómo los anticuerpos están interactuando con el antígeno.Y cómo esa interacción puede ser explotada para diseñar diferentes tipos de herramientas inmunológicas para responder a los diferentes tipos de problemas biológicos. Por lo tanto, después de que las discusiones, hoy, vamos a discutir pocas herramientas más analíticas más inmunológicas, donde el anticuerpo y el antígeno y están interactuando con cada uno.(Consultar el tiempo de la diapositiva: 01:55)Así que, esto es lo que estábamos discutiendo así, lejos que el antígeno si es naturaleza insoluble, usted puede realmente ser capaz de realizar las aglutinaciones o si es soluble en la naturaleza, usted puede ser capaz de realizar las precipitaciones, así como el inmunoensayo radial, así como las inmunoprecipitaciones. Por lo tanto, en la conferencia de hoy, nosotros y después de eso, también tenemos la planificación de discutir acerca de los diferentes tipos de inmunoensayo que también se basan en las interacciones del antígeno de anticuerpostales como ELISA RIA y un blotting occidental. Por lo tanto, después de los inmunoensayos radiales, ahora vamos a discutir acerca de las inmunoprecipitaciones.(Consultar el tiempo de la diapositiva: 02:37)Así que, la inmunopalpitación el principio básico es muy simple, el principio es que donde usted va a tomar las cuentas vacías y estas cuentas vacías realmente van a tener los grupos funcionales. Por lo tanto, con la ayuda de este grupo funcional, lo que va a hacer es que va a conectar el anticuerpo particular, estos anticuerpos van a ser realmente un específico para un antígeno en particular. Y entonces, qué es lo que se va a preparar esta cuentas.En nosotros en un paralelo, lo que usted va a hacer es que usted va a romper la célula y usted va a preparar una célula de lisados. Y en este lysate celular, vas a tener los diferentes tipos de proteínas, que te estoy mostrando con los diferentes tipos de cuentas o diferentes tipos de cuentas de color. Así que estos son todos los antígenos potenciales, que en realidad pueden interactuar con este anticuerpo, y en realidad puede darle al que en realidad puede ser aislado de estos específicos de células de la celda de la línea celular.Así que en el tercer paso, lo que usted va a hacer es que va a incubar estos anticuerpos de borde de la perla con el lisado celular, que en realidad contiene diferentes tipos de anticuerpos, diferentes tipos de antígenos, y entonces cuando usted hace las incubaciones hace uno de estos factores proteináceas de los antígenos van a atar el anticuerpo y entonces usted va a hacer un paso inicial de lavado y entonces usted va a hacer el identificación de este antígeno en particular con la ayuda de varias técnicas decomo puede ejecutarlo en la página de SDS o puede hacerlo como la tinción de plata o puede hacer el blotting occidental con los anticuerpos adicionales cómo realizar este ensayo.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 04:24)Así que, para realizar este ensayo, estos son el siguiente material lo que requiere primero que requiere un almacenamiento intermedio de lisis este almacenamiento intermedio de lisis es necesario para la preparación de un lisado de células. Así que tiene todos los componentes como el búfer, luego NaCl y luego tiene el detergente y luego también tiene el inhibidor de la proteasa. Así que este es un inhibidor de la proteasa que usted tiene que añadir justo antes de reconstituir el buffer de lisis. Así que el inhibidor de la proteasa en realidad va a proteger la célula de la degradación de la degradación por las proteasas que va a estar presente en el lisado de la célula.Aparte de eso, también se requiere un búfer de lavado. Por lo tanto, el buffer de lavado es exactamente esta competencia como el buffer entonces usted requiere EDTA NaCl y NP 40. Y luego también se requiere una pequeña centrífuga para que pueda ser capaz de hacer el pilotaje y todo eso.Mira la mezcla de A-sepharue intenta en el lavado de búfer que contiene 900 milli molar NaCl. Por lo tanto, esta es la consulta de sitio alto que usted va a utilizar, por lo tanto, que va a eliminar la proteína no específicamente vinculada a los anticuerpos, así como a las cuentas para eliminar el enlace no específico. Por último, lavar la mezcla una vez en un buffer de lavado. Así que, ahora, una vez que se hace con el lavado con el buffer de la licencia, así como el lavado con el buffer de lavado, su muestra ya está lista. Y ahora lo que puedes hacer es puedes eluir los antígenos de los anticuerpos y entonces puedes ser capaz de analizarlos.(Referir Slide Time: 08:09)Así que en el paso siguiente en el paso 3, vas a hacer el análisis o muestra en la página de SDS. Por lo tanto, se retira el sobrenadante después de la centrifugación a alta velocidad a la proteína A-sephasured purines abalorios a 800 microlitros de 1 x SDS gel de carga y hervir durante 4 minutos cargar la muestra en el gran pozo del gel de gradiente de la página SDS discontinuo y ejecutar el gel a una temperatura constante de 10 miliamperios.Así, una vez que tiene las cuentas, que en realidad tienen los anticuerpos y los anticuerpos son vinculantes para el antígeno particular de la célula de lisate que tome esas cuentas, lávese eliminar el sobrenadante y luego se añade el 1 x SDS de carga de almacenamiento intermedio y luego se calienta y hervir. Así que en ese proceso todo elintergénico determinante porque el anticuerpo va a ser desnaturalizado cuando lo haces, y el anticuerpo va a liberar el antígeno en el sobrenadante. Y ese sobrenadante lo puedes cargar en la página de SDS.En este caso, estamos usando la página SDS de gradiente para que la resolución vaya a ser aún mejor. Y luego lo corres para a corriente constante para 10 miliamperios. Porque queremos, no queremos crear el calor en el sistema para que haya una desnaturalización del antígeno. Por eso hay que ejecutarlo a una corriente de 10 miliamperios a un ritmo muy, muy lento. Así que en realidad va a resolver las muestras, pero no va a calentar los geles.Entonces usted va a 4 el paso 4 usted puede visualizar las proteínas con la ayuda de la coomasie azul (()) (09:45) manchas azules o la mancha de plata más sensible en este es el estadio lo que también puede hacer es usted puede tomar el SDS gel, y usted puede en realidad puede hacer la mancha occidental con un anticuerpo específico. Por ejemplo, si estoy esperando que actina se presente con un límite a los anticuerpos, lo que puedo hacer es simplemente tomar este sobrenadante de carga en la página de SDS.Puedo hacer una tinción con la coomasie o manchas de plata para comprobar que estoy consiguiendo una banda muy cerca de estos al nivel de la actina, pero alternativamente lo que puedo hacer es simplemente transferir ese gel sobre una membrana de nitrocelulosa y luego puedo hacer un blotting occidental con los anticuerpos de la actina NT, y eso en realidad me va a dar la información específica sobre la proteína lo que está presente en la página de SDS si es una proteína actina o alguna otra proteínas.(Consultar el tiempo de la diapositiva: 10:40)Los resultados de la proteína que interactúa darán una banda extra en el gel de SDS y se pueden caracterizar más al sondear la proteína en la página de SDS con otro anticuerpo en un blot occidental. Por lo tanto, este es un resultado típico de lo que se ve. Así que, en el carril 1 hemos cargado el carril de marcadores moleculares 1 es en realidad sólo anticuerpos, carril 2 es en realidad las cuentas más lisada y el carril 3 es en realidad la reacción completa.Así que, lo que se puede ver es el carril 1 está mostrando alguna banda porque parte de la proteína se une a los anticuerpos, el carril 2 está mostrando más número de bandas y esas son la banda no específica que son realmente vinculantes para el anticuerpo, así como la unión a las cuentas. Por lo tanto, estos 2 realmente van a ser estos 2 la proteína que son de unión a las cuentas, así como la proteína que son vinculantes para sólo anticuerpos o tiene que ser sustraído.Y entonces usted puede realmente ser analizado la muestra que es en realidad en el número 3 donde el anticuerpo, así como el talón más el lisate está presente. Y en esto lo que usted ve es que hay bandas específicas que están apareciendo en esto y ahora lo que usted puede hacer es también puede hacer una mancha occidental de esta muestra con los anticuerpos anti-anticuerpos o anti-antígeno específicos cualquiera que sea el antígeno que usted está esperando que debe presentar en esta inmunoprecipitaciones particulares.O en algunos casos, si usted no está seguro, entonces usted puede pasar con el peso molecular y entonces usted puede probablemente puede hacer un usted sabe adivinar inteligente y entonces realmente ser capaz deprobar la página de SDS con el anticuerpo particular y reconocer o identificar este particular proteína en un enfoque genérico, si usted no sabe ninguna de estas cosas o usted no sabe ni siquiera el camino, entonces lo que se supone que debe hacer es que usted tiene que sacar esa proteína en particular del gel que tiene que hacer (()) (12:36).Así que, que debe producir los péptidos y entonces usted puede enviar este péptido para la espectrometría de masas y entonces usted puede hacer los estudios de proteómica y luego en realidad que también le permitirá identificar esta proteína en particular. Ahora, aparte de la inmunoprecitación, donde realmente está usando el anticuerpo como una sonda, por lo que, que se unirá a las cuentas y luego se puede utilizar que los anticuerpos de enlace de la perla de enlace para obtener las proteínas de la célula de lisate o obtener el antígeno del lisado de la célula.Muchas personas también están usando o también realizando una versión ligeramente derivada de esto, que se llama como el ensayo de extracción. Por lo tanto, en los ensayos de extracción, usted está utilizando los anticuerpos o también está usando la otra proteína que es unirse a las cuentas. Por lo tanto, vamos a discutir sobre el ensayo de retirada que es en realidad una modificación de los ensayos de inmunoprecitación.(Consultar el tiempo de la diapositiva: 13:38)Así que, en un ensayo desplegable, lo que la gente está haciendo es que está tomando cuentas GST y los cebos GST tiene el grupo funcional. Así, que el grupo funcional del grupo GST está presente y que funcional grupo. Por lo tanto, están preparando los 2 cebos uno es el talón de control donde usted tiene los cebos GST con un grupo funcional el otro es el talón de la sonda o el talón de la sonda. Por lo tanto, donde usted está realmenteteniendo las cuentas del GST y en el grupo funcional que tiene la sonda esta sonda también se llama como la proteína de cebo.Así, que la proteína de cebo es una proteína específica en la que a la que le interesa ver cuántas proteínas están interactuando y entonces lo que hace es tomar la célula que se abre con el buffer de lisis para generar el lisado de la célula y el lisado de la célula en realidad contiene los diferentes tipos de antígenos y entonces lo que usted hace es dividir el lisado de la célula en 2 reacciones y luego se incuba estos con la preparación de estos 2 de las cuentas y entonces estas 2 cuentas son realmente va a atar la proteína no específica.Por ejemplo, en este caso ha unido a esta proteína en particular así y mientras que en este caso ha atado la proteína de color amarillo, así como la proteína de color rosa. Así que ahora lo que haces es que hagas un lavado y luego haces la identificación de la proteína con la ayuda de los diferentes tipos de tintes analíticos disponibles o diferentes tipos de blotting occidental a través de experimentos. Por lo tanto, cómo realizar el ensayo de extracción.(Hora de la diapositiva: 15:14)Por lo tanto, la cantidad de sonda que significa que la proteína de fusión GST y la proteína de control añadida deben ser una relación molar equi incubar el tubo durante 1 hora a 4 grados con la mezcla, luego el paso 3, centrifugar la muestra a la velocidad máxima y en un microfugio, lo que significa como 15.000 G.(Consultar tiempo de la diapositiva: 18:36)Luego ir al paso 4 y el paso 4 es un paso de lavado. Y recuerda que lo que estés haciendo, si estás haciendo la inmunopalpitación o haz los ensayos desplegables, siempre tienes que mantener los sobrenadantes que tienes para seguir salvando al sobrenadante. Por lo tanto, que si no habrá proteína presente después del paso final, usted puede ser capaz de cruzar verificar en qué paso ha hecho algo malo para que los complejos de proteínas sean bonos a las cuentas, pero se han desprendido para que usted pueda realmente variar o usted puede ser capaz de optimizar la condición del buffer.Así que en lo profundo, en realidad permite que los complejos de proteínas vengan y se unan a las cuentas, porque eso es muy importante de monitorear. Así que es por eso que en cada etapa en que se está haciendo el spinning y tirando el sobrenadante en lugar de lanzar el sobrenadante se conserva ese sobrenadante en tubos eppendorf adicionales para que puedas ser capaz de cruzar verificar si hay algo que va mal con los experimentos. Así que en el paso 4, usted va a hacer un lavado así que lavar las cuentas con 1 ml de hielo frío GST lisis dos veces, utilizando una centrífuga a la velocidad máxima durante 1 minuto.Y luego se descarta el sobrenadante aunque estoy escribiendo desechar el sobrenadante pero como dije, usted sabe que tiene que preservar el sobrenadante para la verificación cruzada si algo sale mal. Luego el paso 5 vas a hacer elución para eluir la proteína de fusión GST y cualquier proteína que se le vincule añadiendo los 50 microlitros de 20 molares molares de glutatión molar en 50 milímetros de HCl a las cuentas, centrifugar las cuentas durante 2 minutos en una micro centrífuga y luego preparar la muestra. Por lo tanto, mezclar el talón o la proteína eluida con una cantidad igual de 2 x SDS buffer y hervirlo durante 1 minuto y analizar en la página de SDS.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 20:28)El paso 7 que va a hacer el análisis en la página de SDS la proteína asociada con la proteína de fusión podría ser analizada mediante el uso de la coomassie o la tinción de plata por inmunoblotting para un análisis de proteínas específico y también se puede analizar utilizando la espectrometría de masas en alternativas de a esto es que si usted utiliza la radioactividad o si utiliza la proteína etiquetada radioactivamente del lisado, entonces también puede realizar el audiograma automático a Comprobar la presencia de una proteína particular deo simplemente puede hacer radio grama y que en realidad le va a dar el patrón de las proteínas.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 21:08)Veamos cómo se ven los resultados. Así, en los resultados, se va a ver una banda extra en la coomassie o la banda específica con el inmunoblot mostrando la especificidad de la proteína. Entonces, lo que puedes ver esta es una de las imágenes representativas de la literatura y lo que ves es que este es el marcador, entonces el número 1 es en realidad la sonda GST, que en realidad es la totalidad de las opciones, entonces el paso 2 es el GST, que es en realidad el GST solo, y entonces el paso 3 es en realidad la sonda sola.Así que, lo que puedes ver es, esto es en realidad la banda de la sonda, lo que está presente en la reacción número 1 y esta es la banda del GST y lo que puedes ver es que estas 2 bandas que están presentes en esta reacción completa son en realidad una proteína específica que están interactuando con la proteína de cebo o el pro proteínas. Por lo tanto, estas son las proteínas específicas pueden ser identificadas por múltiples métodos, ya sea que usted puede ir con el enfoque de la proteómica, lo que significa, usted puede simplemente hacer el aislamiento de esta proteína del gel y luego hacer la (()) (22:19) y aguas abajo todos los pasos de la proteómica.Y entonces usted en última instancia puede hacer la espectrometría de masas e identificar o realmente puede hacer una mancha occidental con un anticuerpo específico, que en realidad usted puede decir simplemente porque si usted sabe el peso molecular de esta proteína, entonces usted puede decir lo que será el peso molecular de esta proteína en particular y que es cómo usted puede ser capaz de identificar esa proteína en particular. Por lo tanto, estese trata de los ensayos de extracción o de los ensayos de inmunoprecipitación, donde está utilizando el anticuerpo como todas las columnas de afinidad para la recuperación o para aislar un antígeno específico del lisado de la célula.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 23:02)Ahora, vamos a pasar a los inmunoensayos. Por lo tanto, uno de los inmunoensayos es ELISA, ELISA es una técnica inmunológica utilizada para medir el nivel de anticuerpos o antígeno en el fluido corporal, se ha utilizado en los diagnósticos para identificar el antígeno o los anticuerpos de reacción cruzada, ELISA se puede realizar de diferentes maneras para medir el anticuerpo o el antígeno. Por lo tanto, ELISA puede ser realizado como un ELISA directo, ELISA indirecto ELISA, así como el ELISA competitivo y todos estos ELISA están realmente diseñados para medir el nivel de anticuerpos o para medir el nivel de antígeno. Por lo tanto, vamos a discutir sobre cada uno de los ELISA en detalle.(Consultar tiempo de la diapositiva: 23:48)Así que el ELISA directo en el ELISA directo el antígeno objetivo se recubre por primera vez en una placa de pozo múltiple y entonces usted está detectando que por un anticuerpo primario vinculado a la enzima que significa que va a tomar un pozo, lo recubren con el antígeno lo que usted está interesado para identificar y luego va a añadir el anticuerpo primario, lo que significa que va a añadir el anticuerpo que está realmente acoplado a una enzima y entonces lo que puede hacer es sólo añadir el sustrato y ese sustrato le va a dar el color o sustrato es realmente le va a dar algunos readouts.Es sencillo y rápido de realizar debido a los pasos mínimos requeridos. Así que esa es la ventaja de la ELISA directa. Pero la ELISA directa depende exclusivamente de la especificidad de los anticuerpos primarios, lo que significa que no hay control. Así que es por eso que si hay algún problema con la especificidad del anticuerpo primario, en realidad le va a dar los resultados falsos positivos. Es por eso que la especificidad del anticuerpo primario puede verse afectada por la enzima que une el anticuerpo primario y por eso es muy, muy problemático de realizar.Porque una vez que tienes el anticuerpo primario tienes que hacer una reacción de acoplamiento a que la enzima va a ser acoplada al anticuerpo primario y en ese proceso algún tiempo, en realidad afecta la especificidad del anticuerpo en sí. La segunda cosa es porque no tiene el paso de amplificación porque, si usted así, la señal va a ser como proporcional a la cantidad de anticuerpo primario unido al antígeno.Así que, si usted tiene un anticuerpo monoclonal por ejemplo, entonces en realidad va a interactuar sólo con los epítopos únicos lo que está presente en un antígeno particular y en ese caso, la señal va a ser menos muy baja en comparación con si usted está usando un anticuerpo policlonal. Y por lo tanto, si la señal es baja, en realidad va a afectar directamente a la sensibilidad del también.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 25:56)Entonces tiene el ELISA indirecto. Por lo tanto, en el ELISA indirecto, lo que usted está haciendo para hacer es que realmente está recubriendo la superficie con el antígeno entonces usted está recubriendo el anticuerpo primario para detectar el antígeno y entonces usted está agregando el anticuerpo secundario para detectar el anticuerpo primario y entonces el anticuerpo secundario está teniendo la enzima y entonces usted está realmente agregando el sustrato y ese sustrato se está convirtiendo en un producto.Y ese producto le está dando el color o las lecturas legibles y eso realmente se puede hacer. Así, en lo secundario. Por lo tanto, este tipo de ELISA indirecto se está utilizando tanto para medir el nivel de antígeno como para medir el nivel de anticuerpos. Así, esta configuración se utiliza para medir el nivel de anticuerpos en el suero y utilizar para calcular el título de los anticuerpos en la configuración de ELISA indirecta una cantidad conocida de antígeno se recubre sobre el pozo y se incuba con diferentes diluciones de los anticuerpos.El anticuerpo unido al antígeno es entonces reconocido por un anticuerpo secundario vinculado a la enzima un sustrato colorimétrico se utiliza para medir el nivel de anticuerpos. Por lo tanto, vamos a ver cómo realizar el ELISA indirecto.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 27:20)Y cuáles son los materiales que necesita. Por lo tanto, los materiales que usted requiere es el búfer de bicarbonato que usted requiere para el recubrimiento entonces usted requiere la placa de Elisa que es lo que usted requiere para el recubrimiento del antígeno entonces usted requiere las soluciones de antígeno y así, usted prepara la solución de antígeno de 5 microgramos por ml en el biEl pH de carbonato de pH 9.2 entonces usted requiere el BSA que va a ser realmente para un bloqueo y entonces usted requiere el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario y entonces usted requiere el PBS que contiene el Tween 20.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 27:57)Así que, en un procedimiento, lo que usted va a hacer primero usted va a hacer el recubrimiento del antígeno sobre las placas dializadoras de la placa, entonces usted va a incubar que con el anticuerpo primario, entonces usted va a quitar usted va a hacer un paso de lavado para eliminar los anticuerpos unbound,entonces usted va a agregar los anticuerpos secundarios entonces usted va a hacer un lavado para eliminar el exceso de anticuerpos y luego se va a añadir el sustrato y que en realidad le va a dar los colores. Vamos a ver cómo realizar estos pasos.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 28:33)Así que, en el paso 1 usted va a hacer un recubrimiento de antígeno. Por lo tanto, preparas el 5 microgramos por ml de soluciones de antígeno en una memoria intermedia de bicarbonato dispensando los 50 microlitros por pozo de la placa de microtiter que se la ponen durante la noche dentro de la nevera y que es suficiente para que el antígeno se bata a la placa de microtiter entonces se va a hacer un paso de bloqueo. Así, en el paso 2 se bloquea cada pozo con el 1% de BSA en un búfer de bicarbonato para la noche a la mañana. Este paso de bloqueo es necesario porque cuando usted está recubriendo el antígeno, en realidad está recubriendo el antígeno en un pozo.Por lo tanto, usted va a tener las diferentes moléculas de antígeno, pero en entre la molécula de antígeno este este espacio está vacío, lo que significa que el plástico está vacío y este plástico puede proporcionar fácilmente el sitio de conexión para los anticuerpos primarios. Así que, antes de añadir el anticuerpo primario, hay que rellenar toda esta cavidad o rellenar con todo este pozo con nuestra solución proteinácea para que en realidad vayas a cubrir toda la superficie. Por lo tanto, el bloqueo no va a bloquear los sitios epitópicos en el antígeno, pero en realidad va a bloquear todas las superficies restantes lo que está disponible en el pozo.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 29:54)Ahora fue una vez que su bloqueo ha terminado entonces usted puede preparar las diluciones de anticuerpos primarios. Así, usted puede hacer una dilución de 1 es a 100, 1 es a 1000, 1 es a 2000 como que, así que lo que tienes que hacer es que tienes que tomar este 1 y 20 microlitros de suero original y luego lo mezclas con 198 microlitros de PBS que en realidad le va a dar un 200 microlitro 1 es a 1000 muestra diluida entonces usted tiene que hacer una dilución en serie como esa, y que en realidad le va a dar un stock de anticuerpos diluidos en serie y que en realidad puede ser utilizado en un paso posterior para las incubaciones.Entonces usted dispensa los 50 microlitros de cada acción de anticuerpos diluidos en el pozo respectivo, y luego incubado durante 45 minutos para 37 grados Celsius.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 30:59)Luego, en el paso 4, va a hacer un lavado en el lavado durante 4 a 5 veces con PBS que contiene entre 20. Y luego paso 5 hay que añadir los anticuerpos secundarios. Por lo tanto, hay que añadir la concentración adecuada del anticuerpo secundario, y luego se dispensa el 50 micro litro por pozo y se incuba en 37 grados centígrados durante otros 45 minutos. En el paso 6, de nuevo, hay que lavar para que se puedan eliminar los anticuerpos secundarios de la capa de acceso.Y luego en el paso 7, se va a hacer un desarrollo así que dispensar 1 mg por ml de OPD más H2O en el tampón de citrato. Detener la reacción en ácido sulfúrico al 7,5% y tomar la absorbancia a 460 nanómetros. Así que vamos a ver cómo llegan los resultados.(Referir Slide Time: 31:47)Los resultados te darán así donde esta es la concentración de anticuerpos más alta y esta es la concentración de anticuerpos más baja. Por lo tanto, lo que se ve es una reacción de color naranja que es un color lo que se obtiene cuando se utiliza la OPD y lo que usted y si graficar estos absorbancia contra la concentración del anticuerpo, lo que se ve es que en realidad le va a dar una curva sigmoidal y con nosotros usando esta curva sigmoidal, usted puede ser capaz de determinar el título de los anticuerpos.Así que, esto es todo acerca de los pasos teóricos lo que hemos discutido sobre la Elisa indirecta. Ahora, para mostrarles todos estos pasos, puedo llevarles a mi laboratorio para mostrarles una pequeña demo y con esta demo, les vamos a mostrar todos y cada uno de los pasos y, en última instancia, los estudiantes vanpara mostrarle el desarrollo de Elisa, así como que en realidad va a ser útil para que usted entienda todo el proceso.(Video Starts: 32:51)En este vídeo vamos a demostrar cómo utilizar un kit de detección de infecciones patógenas y cuál es el principio subyacente de eso. Así que en su mayoría los kits de detección, inmunoensayo de versión. Por lo tanto, lo que es un inmunoensayo en inmunoensayo, usaremos anticuerpos específicos como anticuerpos monoclonales contra el antígeno específico de la enfermedad o anticuerpos específicos de patógenos, entonces desarrollaremos en el sustrato. Así, esto dará un poco de color pastoso y que será detectado por la lectura del espectrofotómetro.Así que, los pasos incluyen el primer paso es que tenemos que recubrir la placa de cloruro de poliamida con el anticuerpo de captura después de la captura del antígeno real, antígeno específico de la enfermedad. Para suponer en la mayoría de los casos en la infección viral, detectará la proteína de la capa y en la infección bacteriana, la externa (()) (34:02). Este tipo de antígenos que va a detectar. Una vez que el anticuerpo se recubre en la placa, entonces vamos a incubar con la muestra tomada de paciente en allí es la saliva o la muestra de suero.Después de la incubación, vamos a lavar correctamente y luego volver a incubar con el anticuerpo primario específico de ese antígeno en particular. Es principalmente que debe ser anticuerpo monoclonal, de lo contrario, esa detección no es específica. En el siguiente paso, después de lavar el anticuerpo primario sin vincular, vamos a incubar con el anticuerpo secundario que es septravidina conjugado a la HRP. Por lo tanto, una vez que la incubación de anticuerpos secundarios ha terminado, vamos a lavar y esa solución de sustrato en su mayoría es TMB o variantes de TMB también disponibles para la detección de cromophorica mejorada.Entonces vamos a leer el desarrollo de color utilizando espectrofotómetro. Estos son los principales pasos. Así que, en paso a paso, ahora, demostraremos cómo realizar el inmunoensayo con el fin de realizar un inmunoensayo necesitamos los siguientes materiales. Primero necesitamos la placa de pozo de cloruro de poliamida de 96 de pozo que debe ser de fondo plano, luego los otros materiales que necesitamos es el almacenamiento intermedio de recubrimiento que es el sistema de almacenamiento intermedio de bicarbonato que pH 9.6. Por lo tanto, una vez que esté listo se ajusta el pH entonces vamos a diluir el anticuerpo de captura en el almacenamiento intermedio de recubrimiento.A continuación, añadir 100 microlitros dispensar cada uno en esta disipencia. Por lo tanto, una vez que el surtido haya terminado, entonces vamos a incubar esta placa a 4 grados centígrados de preferencia, pero podemos incubar a temperatura ambiente también durante 2 horas. Si estás incubando a 4 grados centígrados tienes que guardarlo de la noche a la mañana de lo contrario 2 horas es suficiente. Así que, ahora tenemos buffer de recubrimiento Así que, he prescindido en el reservorio entonces tomaré el anticuerpo de captura. Tenemos que ver la dilución.Con esto, me gustaría concluir mi conferencia aquí y en el vídeo de demostración, el estudiante podría haber discutido en detalle sobre los diferentes pasos relacionados con Elisa y espero que esto sea útil para que usted realice el ensayo en su laboratorio. Así que, con esto, me gustaría concluir mi conferencia aquí. Gracias.