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Generación de anticuerpos

Hola a todos, este es el Dr. Vishal Trivedi del departamento de biociencias y bioingeniería, IIT, Guwahati. Y hoy vamos a iniciar el nuevo tema y ese tema es la inmunología. Por lo tanto, la inmunología es el campo de la ciencia, que básicamente estudia el sistema inmunológico. Entonces, antes de entrar en los detalles de las herramientas inmunológicas, ¿qué está disponible con nosotros y cómo explotarlos?
Tenemos que entender cómo funciona el sistema inmunológico y así, que usted será capaz de entender en qué contexto vamos a ser capaces de utilizar estas herramientas y cómo explotarlas para comprender los diferentes tipos de problemas biológicos.
(Ver Diapositiva: 01:43) Así, el sistema inmunitario es el sistema que protege al organismo contra los patógenos invasores y se trata de reacciones específicas, que inducidas en un huésped por un estímulo antigénico se conoce como la respuesta inmune. Por lo tanto, una vez que un antígeno extranjero como la bacteria, el virus o el hongo entran en el huésped, en realidad reconoce este organismo en particular como el no ser y en respuesta al no ser, el sistema inmunológico es que no está ejerciendo las reacciones, que en realidad van a destruir a este organismos extranjeros.
Por lo tanto, colectivamente todas las respuestas que se están desarrollando contra un antígeno extranjero se conoce como la respuesta inmune y estas respuestas inmunes podrían ser de 2 tipos diferentes, podría ser una inmunidad humoral mediada o la inmunidad mediada por células. En la inmunidad humoral una inmunidad mediada principalmente el complemento de anticuerpo y otros componentes humorales están mediando este tipo particular de inmunidad que significa, todos los medios de respuesta humoral, toda respuesta lo que está siendo mediado por el componente líquido.
Por ejemplo, si la célula está secretando alguna célula citolítica de enzimas están secretando la célula de anticuerpos están secretando los halagos y todos estos realmente están circulando dentro de la sangre y en realidad están monitoreando continuamente los organismos extranjeros. Por lo tanto, tan pronto como el organismo extranjero entra en el cuerpo, esta respuesta humoral en realidad está reconociendo estas células y entonces o están matando estas células o realmente están tomando la ayuda de la respuesta inmune mediada por células.
Por eso, la respuesta humoral proporciona la diferencia contra el patógeno bacteriano, así como el patógeno viral. Por lo tanto, la respuesta humoral es la respuesta fea, que se está desarrollando contra los patógenos muy mortales como la respuesta bacteriana o la respuesta viral, por ejemplo, cuando nos llegan los resfriados o las infecciones de influenza, nosotros la primera respuesta, que viene es la respuesta humoral fácil que es, el virus es reconocido por los anticuerpos.
Así como los demás componentes de la respuesta humoral e intentan provocar la respuesta inmune. Del mismo modo, si habrá una infección bacteriana, el complemento, así como el sistema relacionado en realidad se ha activado, y es así como destruyen las células bacterianas respuesta humoral siempre tomar la ayuda de la respuesta de la célula mediada para crear una respuesta más robusta y duradera.
Por lo tanto, la otra respuesta es la inmunidad mediada por células, donde se involucran las células como las células T y B, protege el organismo contra el virus de los hongos y los patógenos bacterianos intracelulares facultativos, y proporciona también proporciona la inmunidad contra los cánceres. Por lo tanto, la respuesta inmune mediada por células es más robusta, de larga duración y en realidad crea una memoria dentro de los organismos.
Por lo tanto, siempre que habrá una segunda ronda de entrada de los patógenos similares, en realidad reconoce instantáneamente este patógeno y crea la respuesta inmune robusta y la respuesta inmune mediada por células es contra los hongos, virus y especialmente los patógenos intracelulares. Por ejemplo, la tuberculosis mycobacterium y además de eso, cuando la célula se está volviendo irregular o la célula se está transformando realmente en las células cancerosas, la respuesta inmune mediada por células también está actuando contra las células cancerosas para eliminarlas del cuerpo.
(Véase el tiempo de la diapositiva: 05:51) Por lo tanto, dentro de la respuesta humoral, el anticuerpo es la molécula central, que está teniendo lugar o que está realmente gobernando los diferentes tipos de respuestas inmunes que involucran los diferentes tipos de células. Y es por eso que antes de entrar en el detalle de las nuevas respuestas inmunes, es importante entender la estructura del anticuerpo inmunológico, para que se pueda entender la interacción del anticuerpo con el antígeno así como las otras aplicaciones del anticuerpo. Por lo tanto, el anticuerpo es una estructura en forma de Y o molécula en forma de Y.
Que en realidad contiene las 2 cadenas uno es la luz, donde el dinero es la cadena pesada y el otro es llamado como la cadena de luz esto, por lo que, usted tiene la cadena 2 pesada y las 2 cadenas de luz, que se están enlazando entre sí por los puentes de sulfuro entre el pesado, así como la cadena de luz y aparte de eso, por lo que, esta molécula en forma de Y tiene 2 región. Una es la región de la cadena pesada que se llama o la región C terminal que se llama como la región constante.
Y la región superior que es formada por la cadena de luz, así como la cadena pesada se llama como el sitio de enlace de antígeno. Por lo tanto, usted puede imaginar que cada vez que habrá un antígeno, que está llegando a la vecindad de los anticuerpos, en realidad está interactuando con esta porción en particular y esta porción en particular está reconociendo este antígeno y si la interacción es lo suficientemente estable, en realidad va y se une al sitio de enlace de antígeno.
Aparte de que este anticuerpo es muy, muy susceptible para algunas de las proteasas. Por lo tanto, si usted, por ejemplo, si usted trata este particular, el anticuerpo con la proteasa, la mayoría de las proteasas están escinando este anticuerpo en 2 partes, pero están manteniendo la región constante lejos de la región soportable o la región de unión al antígeno. Por lo tanto, es así como usted puede ser capaz de ajustar la producción del anticuerpo de antígeno de tal manera que en realidad va a activar la maquinaria celular, pero no será unirse al antígeno.
Por lo tanto, debido a que esta región es una región constante en realidad tiene un receptor para sobre la superficie celular. Entonces, ¿qué sucedió cuando el antígeno se une a este anticuerpo en particular, esta región constante es vinculante para un receptor? Y así es como en realidad está gobernando nuestra señalización descendente en la célula. Y así es como en realidad está provocando las respuestas inmunes de esas células en particular.
Y así es como los anticuerpos que en realidad están circulando en la sangre son vinculantes para el antígeno y es así como está realmente trayendo los anticuerpos unidos al antígeno al receptor, y es así que en realidad está activando esas células para causar la respuesta inmune más robusta. Aparte de eso, debido a que el antígeno es de unión a este sitio de enlace de antígeno en particular, no está aleando el antígeno para moverse.
Por ejemplo, si usted tiene bacterias, lo que en realidad podría ser peligroso para el huésped, las bacterias no pueden replicarse hasta que se está moviendo libremente. Por lo tanto, lo que sucedió es que la bacteria se va a unir a esta región en particular de la molécula y como resultado la bacteria va a ser secuestrada en un área muy pequeña. Por lo tanto, los anticuerpos están principalmente haciendo 2 función principal uno está realmente secuestrando el antígeno a un área muy, muy localizada.
Así, que las otras células tales como los macrófagos y las células dendríticas, y todos los otros tipos de células T y células B realmente vienen a esa vecindad en particular y podrían ser capaces de destruir este antígeno extranjero en particular, aparte de que este anticuerpo unido al antígeno en realidad va a unirse a los receptores presentes en las células inmunes. Y así es como en realidad va a activar la señalización aguas abajo y esa señalización aguas abajo.
En realidad podría ser capaz de activar la respuesta inmune más robusta de esas células, o sería en la forma de producción de más cantidad de anticuerpos o podría ser de hecho, en la forma de producción de las enzimas citolíticas, los radicales libres todos los otros tipos de respuestas inmunes, por lo que, que el antígeno extranjero particular o los organismos patógenos extranjeros podrían ser destruidos por esto. Por lo tanto, esta es la función principal de los anticuerpos en el, que está participando en la respuesta inmune, veamos cómo se están produciendo los anticuerpos en un huésped como los humanos.
(Ver Diapositiva: 11:12) Por lo tanto, la generación de anticuerpos es un proceso de 4 pasos en un organismo en las condiciones naturales, tiene una fase de retraso. Por lo tanto, en la fase de retraso, lo que está sucediendo es que, en realidad es el en esta fase en particular habrá una entrada de patógeno y entonces este patógeno va a ser contactado por las células inmunes. Por lo tanto, se trata de una fase de retraso que también podría denominarse fase preparatoria.
Donde el antígeno extranjero entrará en el cuerpo del huésped y entonces este antígeno extranjero va a ser reconocido por las células inmunes y entonces realmente van a iniciar la preparación para cómo hacer frente al antígeno extranjero en la segunda fase, usted tiene la fase de registro. Por lo tanto, entonces la fase de registro que en realidad va a ver, habrá un aumento en la producción de anticuerpos. Lo que significa que las células inmunitarias ahora han adquirido o entendido las estrategias de cómo hacer frente a este antígeno extranjero en particular.
Y luego han pasado por múltiples procesos y en qué procesos y después del final de estos procesos, han empezado a producir los anticuerpos y ellos como dije en la propia diapositiva anterior, que estos anticuerpos ahora empezarán a secuestrar este antígeno. Por lo tanto, que no debe ser capaz de propagarse por todo el cuerpo. Entonces en la tercera es la fase de meseta la meseta será el equilibrio entre la síntesis de anticuerpos, así como el catabolismo.
Por lo tanto, en esta etapa en realidad, el antígeno extranjero está a punto de ser eliminado del cuerpo o porque en esta etapa la producción de anticuerpos, así como el anticuerpo que está unido al antígeno o que ya ha sido consumido va a ser el mismo. Por eso si ves que la producción de anticuerpos va a ser constante en toda esta región y entonces vas a tener la fase de descenso. Por lo tanto, habrá una disminución del título de anticuerpos que significa, la producción de anticuerpos va a ser baja.
Por lo tanto, en esta etapa, la infección se va a sostener a un área localizada particular. Pero aún así la infección de intensidad activa está ahí. Por lo tanto, la producción de anticuerpos, así como la destrucción va a ser constante y luego se entra en una fase de descenso donde los anticuerpos van donde se va a eliminar el antígeno del cuerpo, lo que significa que con el organismo se ha eliminado la infección del cuerpo y es así como no habrá necesidad de producir los anticuerpos y es así como se va a disminuir la producción de anticuerpos.
En esta etapa sólo el organismo va a empezar a producir las células de la memoria o en realidad va a entrenar a la célula para que realmente vaya a mantener una memoria de este antígeno extranjero en particular. Por lo tanto, siempre que esto ocurra en la segunda respuesta o la segunda vez, el tiempo que el organismo ha tomado para la fase de retraso, así como la fase de registro para hacer el paso preoperatorio se va a acortar.
Y como resultado, si el mismo organismo llega a la segunda etapa, es la respuesta inmune va a ser la más rápida y eso es lo que la razón es que cuando estás vacunando a los niños es o incluso a los adultos, en realidad estás haciendo nada, pero la reducción de las estancias preparativas para que en cuanto llegue el organismo, el cuerpo comenzará a producir los anticuerpos y entonces estos anticuerpos en realidad van a empezar a secuestrar el antígeno a un área localizada y luego empezar a actuarlos, para que el sistema inmunológico los vaya a eliminar.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 15:02) Ahora, veamos cómo son necesarios los diferentes eventos para obtener los anticuerpos producidos en los organismos. Por lo tanto, el primer evento es que el antígeno va a entrar en el cuerpo del huésped y entonces, tan pronto como el antígeno entrará en el cuerpo del huésped, las primeras células que van a ser activadas o la primera célula que van a encontrar estos antígenos son llamadas como células que presentan antígeno, estas células son o bien los macrófagos o las células dendríticas.
Así que, en cada parte del cuerpo, donde existe la posibilidad de que tengas la entrada de los antígenos extraños, tienes los macrófagos así como la célula dendrítica por ejemplo, tienes las células kupffer, que están presentes en el hígado, tienes los macrófagos alveolares, que están presentes en los pulmones, y luego tienes los macrófagos en cada órgano, de modo que será cualquier infección que vaya a ese órgano en particular.
La primera célula que va a encontrar este antígeno extranjero en particular es estos macrófagos. Entonces, cuál es el trabajo de estos macrófagos es que en realidad van a procesar el antígeno lo que es medio por proceso el antígeno es que en realidad van a digerir este antígeno y van a generar los péptidos antigénicos, lo que significa que el organismo va a ser destruido y entonces en realidad se está seleccionando los antígenos.
Usted está seleccionando los péptidos que son antigénicos y entonces estas células presentadoras de antígeno presentarán estos antígenos o los péptidos antigénicos con la ayuda de la clase 2 de MHC, una vez que presenten este péptido antigénico con la clase 2 de MHC, éstos van a activar las células T-helper y las células T-helper en respuesta al antígeno que se presenta a la clase 2 de MHC realmente va a activar las células B aguas abajo y una vez que las células B son activadas.
Ellos van a producir el anticuerpo que realmente va a volver a estimular aún más estas acciones. Así que para el antígeno está entrando en el cuerpo y las células que presentan el antígeno están realmente reconociendo los antígenos sin la ayuda de ninguna herramienta. Por ejemplo, habrá una bacteria, el antígeno que presenta las células está reconociendo la bacteria sólo por las proteínas que están presentes en la pared celular bacteriana.
Pero, en cuanto habrá activación de las células B, los anticuerpos se van a producir y entonces en realidad van a recubrir las bacterias con este anticuerpo en particular. Y eso en realidad va a permitir que el antígeno presente las células para reconocer estas bacterias de manera más eficiente con la ayuda del receptor de la superficie celular, porque ahora no son dependientes del antígeno que se expresa en la bacteria.
Debido a que la cantidad de antígeno que se expresa en la bacteria es muy pequeña o muy pequeña en comparación con los anticuerpos, que van a ser un enlace a esta bacteria en particular y el receptor para ese receptor en particular para el anticuerpo va a ser con el ir a ser más eficiente vincular la célula que presenta el antígeno y que es cómo la totalidad de esta cascada va a ser amplificada.
Mientras tanto, las células B se van a diferenciar en las células plasmáticas, y entonces las células de plasma van a empezar a producir los anticuerpos, estos anticuerpos van en contra de ir a participar en las respuestas inmunes. Por lo tanto, esto es lo que se va a mostrar en la figura donde el antígeno va a ser procesado por el antígeno que presenta células como los macrófagos, y luego se va a expresar junto con el MHC clase 2 y entonces eso en realidad va a activar las células T-helper.
Y las células T-helper de nuevo van a activar las células B y esa etapa la célula B se va a diferenciar en 2 células, una se llama como las células de plasma La otra se llama como las células de la memoria y luego las células de plasma comenzarán a producir los anticuerpos y estos anticuerpos en realidad van a contribuir aún más en la respuesta inmune más robusta porque estos anticuerpos son solubles en la naturaleza.
Por lo tanto, en realidad van a activar las más células y una respuesta inmune más robusta porque el propósito del anticuerpo es secuestrar el antígeno, así como amplificar la señal inicial por lo que, que en realidad va a activar las respuestas inmunes completas.
(Consultar Tiempo de Slide: 20:13) Ahora, entendamos lo que significa el policlonal, así como el anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, los anticuerpos lo que está siendo producido por un organismo podría estar en 2 categorías, uno se llama policlonal el otro se llama como los anticuerpos monoclonales. Así que, ahora, lo que se puede imaginar, lo que se puede ver es que se tiene un antígeno, se puede imaginar que se trata de una proteína muy grande, que en realidad contiene los múltiples tipos de sitios antigénicos.
Y todos estos sitios antigénicos se llaman como los epítopos que significa que nuestro antígeno podría tener los múltiples epítopos como 1, 2, 3, 4, 5 y 6 y todos estos epítopos cuando van a ser procesados por el antígeno que presenta las células se van a expresar junto con la clase de MHC dos y subsecuentemente. En realidad van a activar las células B y entonces las células B van a activar las células plasmáticas.
Así que, en este proceso, lo que sucederá es que, en realidad van a activar las múltiples células plasmáticas. Por lo tanto, usted va a tener por ejemplo, si usted está procesando el epítopo 1 en realidad va a activar un tipo de células de plasma y que en realidad va a empezar a producir los anticuerpos. Del mismo modo, usted tiene los epítopos 2, 3, 4 y 5 todos estos epítopos están realmente produciendo los diferentes tipos de anticuerpos.
Que son anticuerpos, que se dirigen contra un anticuerpo que se dirige contra 2 y así sucesivamente. Entonces, lo que sucederá es que, si recolectas todos estos anticuerpos, que vienen de las diferentes células, por ejemplo, esto es el número 1, esto es 2, esto es 3, esto es 4 y esto es 5. Por lo tanto, si usted está recolectando los anticuerpos, que vienen de los 5 o más tipos diferentes de células, como diferentes tipos de células de plasma, que son en realidad los clones.
Entonces el anticuerpo se llama como el anticuerpo policlonal, que significa el poli significa, muchos medios clonales, los clones que significa, si los anticuerpos vienen de los múltiples clones de los antígenos múltiples o los antígenos, pero un epítopos múltiples de un solo antígeno, entonces el anticuerpo resultante se llama como el anticuerpo policlonal. Mientras que, si se ven los epítopos número 6, en realidad va a ser procesado por la célula de plasma único y que en realidad le va a dar los anticuerpos.
Y estos anticuerpos van a llamarse como anticuerpos monoclonales. Mono significa que el clon es clonal único. Por lo tanto, si un solo epítopos está siendo procesado por el clon único y usted está recolectando los anticuerpos de un solo clon. Luego se llama como los anticuerpos monoclonales lo que significa, el anticuerpo monoclonal, policlonal significa que los anticuerpos de los muchos clones y anticuerpos policlonales se van a producir dentro de los animales bajo las condiciones naturales.
Por lo tanto, bajo las condiciones naturales cuando una bacteria va a ser procesada en un organismo, no produce el anticuerpo monoclonal, produce los anticuerpos contra los múltiples epítopos de un solo antígenos. Lo que significa que podrían ser múltiples proteínas y una combinación de múltiples proteínas o podría ser un epítopos múltiples o múltiples regiones antigénicas presentes en el antígeno único independientemente de estas condiciones.
El propósito de producir un anticuerpo policlonal es que desea aumentar los múltiples anticuerpos posibles para un único antígeno. Por lo tanto, que usted será capaz de reconocer estos antígenos y usted será capaz de crear nuestra respuesta inmune robusta en comparación con que el anticuerpo monoclonal significa los anticuerpos de un solo clon. Porque, no se puede hacer eso naturalmente porque, no se puede tener ninguna manera de pedir al cuerpo que solo seleccione un solo clon y comience a producir los anticuerpos.
En realidad se ha hecho por nuestra técnica in vitro, que se llama tecnologías de hibridoma. Así, estas son las 2 formas en las que se puede poder producir los anticuerpos uno el anticuerpo policlonal, donde se puede utilizar directamente los animales o los anticuerpos monoclonales, donde hay que utilizar una tecnología de hibridoma para seleccionar el clon y luego pedir al clon que produzca anticuerpos. Por lo tanto, esto es lo que vamos a discutir en esta conferencia en particular.
(Ver Diapositiva: 25:20) Por lo tanto, la generación de anticuerpos policlonales en una generación de un anticuerpo policlonal, hemos discutido cuando estamos discutiendo acerca de la cromatografía de afinidad. Por lo tanto, no vamos a discutir eso en detalle, pero excepto que sólo para su refrescante su memoria, lo que hemos discutido es que usted puede tener los 2 tipos diferentes de antígeno ya sea el hapten para hapten también va a estar presente o va a ser convertido en el antígeno con la ayuda de la proteína portadora como el borde de la col o alguna otra proteína portadora.
Así, que las haptenos se van a convertir en el antígeno haptens son los antígenos, que no son inmunogénicos. Por lo tanto, usted puede tener los antígenos, que son inmunogénicos que significa, pueden ser capaces de crear una respuesta inmune robusta o usted puede tener los antígenos, que son no inmunogénicos. Por lo tanto, estos haptens son los antígenos no inmunogénicos, por lo que, hay que convertirlos en antígenos inmunogénicos, y eso que tiene que hacer simplemente añadiendo una proteína portadora.
Así que, su tamaño en realidad va a subir porque las haptens son no inmunogénicas porque son de pequeño tamaño. Por lo tanto, hay que añadir etiquetas a una proteína portadora como el borde kale o BSA o cualquier otra proteína portadora inmunogénica por lo que, que van a causar una respuesta inmune entonces, estos son los antígenos profesionales, que son inmunógenos también, entonces usted tiene que procesarlos para hacer una preparación que significa que el antígeno se va a mezclar con el usted tiene que hacer el antígeno listo para la inmunización.
Entonces hay que inmunizar a los animales por esta preparación de antígeno, luego una vez inmunizar a los animales, hay que probar el animal para la generación de los anticuerpos, una vez que se confirme que los anticuerpos se están produciendo, entonces se puede ser capaz de desangrar a los animales y luego en última instancia se puede recoger el suero y de este suero se puede hacer la purificación de los anticuerpos, y eso en realidad le va a dar los anticuerpos policlonales, y como expliqué en la propia diapositiva anterior.
Por qué es policlonal porque el antígeno va a estar formado por múltiples epítopos. Y así es como los múltiples epítopos van a estar activando las múltiples células B y, en última instancia, las múltiples células B se van a convertir en las múltiples células plasmáticas y es así como van a obtener los anticuerpos de los múltiples clones y eso es todo lo que va a ser anticuerpos policlonales.
(Ver Diapositiva Hora: 28:05) Para un anticuerpo monoclonal, el proceso es poco más complicado porque en esto usted tiene primero usted va a inmunizar a los animales y entonces usted va a producir los múltiples clones y luego estos múltiples clones tienen que ser que usted sabe se proyectó y entonces usted tiene que seleccionar el clon único. En un anticuerpo monoclonal, lo que tienes que hacer primero es tomar los antígenos, entonces significa que tienes que producir el antígeno en grandes cantidades.
Entonces tienes que hacer una emulsificación de este antígeno, por lo que, que podrás hacerlo listo para la inmunización, entonces tienes que hacer la inmunización de estos animales, entonces tienes que probar los anticuerpos, si los anticuerpos se están produciendo o no, y entonces vas a hacer el sangrado, luego se recolecta el suero y luego se prueban los anticuerpos. Por lo tanto, una vez que usted prueba eso, hay suficiente cantidad de anticuerpos están siendo presentes en este animal en particular.
Entonces usted toma estos animales y la preparación de las células B del bazo, y luego usted también cultura las células de mieloma, y luego fusiona el mieloma y las células B para formar el hibridoma entonces usted pantalla las células de fusible y luego en última instancia usted va a cosechar los anticuerpos monoclonales del clon único.
(Consultar tiempo de la diapositiva: 29:30) Veamos cómo hacer estos procedimientos. Por lo tanto, en una producción típica de anticuerpos monoclonales, como comentamos primero se toma el antígeno, se inmunizan a los animales, se recogen estos spleens, entonces, en un lado que se recogen cultura las líneas de células de mieloma, se toman las células de mieloma, las mezclan junto con las reacciones de fusión que contendrán el polietilenglicol que en realidad le va a dar las hibridomas.
Estos hibridomas se pueden cultivar en la cultura de masas, para que puedas ser capaz de producir los anticuerpos o si puedes congelar estos hibridomas Así, que siempre que se requiera, solo puedes sacar estos hibridoma inyectados en el animal, para que en realidad te vaya a saber recuperar del de la congelación y luego podrás ser capaz de producir anticuerpos. Por lo tanto, estos son los múltiples pasos que usted requiere para desafiar a los animales.
Así, la purificación de los antígenos, el antígeno utilizado para inmunizar para ser tan puro como el uso posible del antígeno puro reduce la generación de anticuerpos de reacción cruzada, ya hemos discutido acerca de cómo preparar el antígeno se puede preparar el antígeno bajo la condición nativa simplemente haciendo técnicas de cromatografía o se puede preparar el antígeno bajo condición de natural con la ayuda de las ilusiones electro. Una vez que su antígeno está listo, entonces usted tiene que preparar el inmunógeno.
Por lo tanto, lo que usted hace es combinar los 100 microlitros de antígeno con la misma cantidad de líquidos adyuvante completo a un volumen final de 200 microlitros luego se mezcla a fondo para obtener la emulsión usando una jeringa o una pipeta. Usted tiene que comprobar la emulsión si es una buena emulsión o no simplemente por dejar caer una pequeña gota de emulsión en el agua y lo que es lo bueno es una buena emulsión no se esparcirá en la superficie del agua lo que significa que la emulsión va a permanecer intacta cuando incluso si lo suelta en el agua.
(Consultar tiempo de la diapositiva: 31:34) Entonces antes de la inmunización se saca la sangre y para que en realidad le vaya a decir si lo que es el título de los anticuerpos presentes en el animal antes de que la inmunización incuba la muestra en 4 grados y luego usted recoge el suero y usted puede mantener este suero y etiquetado como un suero pre-inmune que significa que usted puede recoger el suero y almacenarlo a menos 20 grados y que se considera va a ser un suero pre-inmune que en realidad va a ser un suero de control.
Para que te diga cuál es la cantidad de anticuerpos presentes en su animal paga por hacer las inmunizaciones, entonces vas a hacer las inmunizaciones, sacas los animales o los ratones en este caso con la ayuda y que una cepa lo que vas a usar es la cepa BALB/c, primero las esteriliza con la ayuda del alcohol al 70%, entonces vas a inyectar la mezcla de antígeno lo que hemos preparado y durante este paso o bien utilizar como ayudante.
De modo que vamos a sostener ratones o se puede utilizar un dispositivo de tensión para mantener a los ratones brevemente limpiar el sitio de inyección con el 70% de etanol e inyectar antígeno a través de múltiples rutas. Por lo tanto, usted tiene varias rutas a través de las cuales puede ser capaz de inyectar los antígenos, ya sea que se puede inyectar como una mezcla de intención intravenosa, por lo que se puede inyectar directamente en la vena de la cola de este ratón. Así que en realidad va a crear una respuesta inmune muy pequeña porque si se inyecta directamente en las inyecciones intravenosas, en realidad va a causar los choques ópticos de la NFL.
En primer lugar, y el segundo es que en algún momento en realidad clara la infección transparente el antígeno muy rápido para que no va a crear una respuesta inmune muy robusta. Por lo tanto, solo puede inyectar antígeno en un modo intravenoso si sabe que el antígeno es muy, muy inmunogénico. A continuación, se puede inyectar en una inyección intraperitoneal mientras que las inyecciones de IP evitan inyectar el antígeno en el estómago porque se quiere hacer una inyección intraperitoneal.
Pero no se lo inyecten en el estómago porque de lo contrario, en realidad va a crear un montón de problemas a los ratones, entonces también se puede hacer una inyección subcutánea o intramuscular y que se puede hacer en los músculos del muslo y este tipo de inyecciones son en realidad crea una respuesta inmune robusta porque la entrega del antígeno permanece muy por un tiempo muy, muy largo porque cuando se inyecta en los músculos o en el subcutáneo esa área es accesible para el sistema inmunológico para y no es inyectable también para el suministro de sangre.
Así que es por eso que el antígeno permanecerá con el cuerpo durante un tiempo muy, muy largo y que en realidad va a crear una respuesta inmune robusta.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 34:44) Después de la inyección, mantenga los ratones de nuevo en la jaula y luego usted va a hacer otra inyección después de algún tiempo. La única diferencia es que usted va a utilizar el adyuvante incompleto del freund así que en las inyecciones primarias usted va a utilizar el adyuvante completo del freund en las inyecciones secundarias usted va a utilizar los adyuvantes incompletos del freund a un volumen final de 200 microlitros mezclar a fondo para obtener una emulsión y esto es todo va a ser igual. Así que cuando usted hace las inyecciones secundarias con el adyuvante incompleto del freund, en realidad va a crear las células B de la memoria.
(Vea el tiempo de la diapositiva: 35:21) Entonces usted va a hacer un título de anticuerpos. Así que antes de proceder más a tomar nota sacando nuestro bazo y generando el hibridoma hay que asegurarse de que el anticuerpo se está produciendo. Así que lo que vas a hacer es que sacas la sangre de los ratones y ya sabes, prepara el suero de los ratones y luego vas a generar determinar el nivel de anticuerpos con la ayuda de la ELISA. Y usted va a utilizar el ELISA indirecto que es lo que vamos a discutir en las conferencias posteriores.
(Consultar Tiempo de Slide: 35:57) Así que, hasta esto, hemos inmunizado a los animales y tenemos el anticuerpo que produce los animales. Así que, en posteriores a eso ahora, ya que tenemos los animales inmunizados, podemos seguir adelante para generar las hibridomas y para cribar las hibridomas y luego para hacer circular el monoclonal un