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Por lo tanto, la última clase de lo que hablábamos, estábamos discutiendo acerca de las diversas células de la planta de transformación genética, cuáles son las diferentes maneras en que las células de las plantas pueden ser transformidas.Así, estábamos hablando de que generalmente en la literatura se encuentra que se utilizan las transformaciones de agrobacterium. Los propios agrobbacterianos son ingenieros naturales a trans, tienen la maquinaria para transformar correctamente las células de la planta a través de una sección de ADN presente en ellos el ADN plasmido que se llama el ADN que se integra establemente. Por lo tanto, cómo hemos explotado es que el ADN T-ADN inherente presente en el agrobacterium que se desarma que se quita, y otros vectores como los que tienen este segmento de T-DNA,a que agrobacterium tiene la maquinaria para integrar este vector plásmido que ha sido añadido en la agrobacterium para integrarse en las células de la planta. Entonces, ahora cuáles son los diferentes tipos de vectores que estamos discutiendo la última vez, los vectores comúnmente utilizados son vectores.Ahora, los vectores binarios por qué se llaman origen binario de las replicaciones, pueden replicatein E. coli, así como en agrobacterium. Y entonces, qué más la transferencia conyugal puede tener lugar entre E. coli a agrobacterium, y de agrobacterium a las células de la planta. Ahora, también estaba hablando de otros vectores que pueden ser utilizados para la transformación genética en las células de la planta. Estos son los vectores intermedios que son como por ejemplo, pBR3 doble dos, usted va a escuchar si usted trabaja en este área. Estos son los vectores de tamaño más pequeños en E. coli a, que contenía el T-DNA y se utilizan para superar los problemas debido a la gran tamaño del plásmido de Ti. Así, como estaba diciendo que hay un plásmido ayudante presente en la agrobacterium que es disarmed.Ahora, esto se llama como plásmido ayudante, que tendrá virulencia Ahora, este pequeño plásmido se puede multiplicar en el E. coli I y luego a través de transferente conyugal se puede traer en el agrobacterium. Ahora, estos plásmidos en agrobacterium, no pueden multiplicarse, pero luego pueden ser transformedque pueden ser utilizados para transformar las células de la planta. Ahora, co-integradora, a veces lo que sucede que debido a que hay una recombinación.Ahora, en la agrobacterium, algunas de las regiones de T-DNA que han sido desarmadas, pero las otras regiones si hay un homólogo si hay una similitud entre ese ADN componentto el ADN que está presente en estos vectores, entonces Se llevaría a cabo la transformación, se llevaría a cabo la transformación, y habrá un material genético de intercambio, el intercambio de material genético. Y este T-DNA donde su región de MCS está allí, donde esto se integra en el plásmido individual de la entidad, que luego puede actuar como un plásmido Ti completo para que la transformación suceda en las células de la planta, por lo que entonces se llama como plásmido co-integrador. Entonces vectores de ayuda, vectores de ayuda, ya sea que usted tiene su plásmido inherente Ti que ha sido desarmado, desarmado significa que las regiones oncogénicas han sido el T-ADN ha sido takenout. Por lo tanto, o tiene plásmidos separados que ayudan en el evento de transformación, que son regiones de transferencia que ayudarán en el transporte de este ADN T-T de sus pequeños vectores.Ahora, estos son pequeños plásmidos mantenidos en E. coli, estos son plásmidos ayudantes para E. coli a la transferencia de transformación de agrobacterium. Ellos contienen regiones de transferencia y regiones de movilización, que permiten la transferencia de los vectores intermedios deficientes conyugales en el agro. Supongamos que si hay conjugación que está ausente, no todos los vectores son vectores conyugales. Por lo tanto, si la conjugación está ausente, entonces usted necesita plásmido ayudante que puede ayudar en la transferencia de estos vectores en el agrobacterium.Así, esto es lo que yo estaba diciendo co-integradores vectores donde la recombinación homóloga entireone plásmido co-integrativo dentro de la agrobacterium se puede obtener. Ahora, ¿cuáles son las diferentes técnicas de transformación, ya sea lo que es bien conocido que se utiliza en los laboratorios es la técnica de co-cultura uno es que, y el otro es directechniques en la transformación de planta. Las culturas y la regeneración de las culturas in vitro se hacen para obtener la planta transformadora; de lo contrario, directamente las partes de la planta pueden transformarse en la propia semilla o en el cigoto, o en el momento de la polinización de la floralpolinización, justo antes de la polinización cuando las flores son el método de inmersión de flores o el método de floraldip a través del cual la agrobacterium puede entrar en la planta. Y después de la polinización puede transformar el cigoto, por lo tanto en la progenie se verá la transformación. estamos usando agrobacterium como una herramienta para transferir o indirectgene métodos de transferencia, por ejemplo, gene gun que es lo que creo que usted debe tener rumores. Y hay otros métodos que vamos a ver. Así, los métodos de agrobacterium mediado, lo que es lo que se hace son los requisitos previos para la transferencia de genes de agrobacteriummediada, involucra a los explantes, los explantes deben producir acetosyringone. ¿Qué fue la acetosoringone?. Por lo tanto, esto se utilizó para inducir a los genes de la virulencia presentes en el agrobacterium. Así, la acetosyringone, por lo que el tipo de explantes, la edad del explant también a veces matterspara las transformaciones exitosas. Por lo tanto, tiene que haber producción de estas moléculas de señalización que pueden atraer el agrobacterium y la reducción de la proximidad entre el agrobacterium y las células de la planta. Ahora, el explant debe producir acetosyringone u otros compuestos activos otros compuestos fenólicos orden para inducir los genes de virulencia. A continuación, la agrobacterium debe tener acceso a las células que son competentes para A veces se observa aunque la transformación se hace, pero la regeneración no sucede. Para que la regeneración suceda, se necesitan células competentes para la transformación, y luego se debe mantener el totipotencicyto en las células transformadas para llegar a la planta regenerante, por lo que es una tarea difícil no tan fácil.Por lo tanto, ahora que la transformación exitosa de agrobacterium en el acceso de las células competentes es necesaria, no todas las células serán competentes en la naturaleza. A veces veréis que un método similar, pero seguiréis repitiendo que sólo algunos tendrán éxito, los demás pueden no ser debido a todas estas regiones, no todas las células en el caso serán de la misma naturaleza bioquímica. A continuación, se utilizan para la transformación el tipo de explicación de la edad de los explantes.Ahora, por lo general, se prefiere que se dividan activamente las células cuando se debe hacer una transformación. ¿Por qué se prefieren los jóvenes explícitos, no viejos, por qué piensa usted?. Incluso para la transformación, la regeneración es el segundo paso. Para que la transformación exitosa suceda es preferible que trabajes con las plantas jóvenes con células que se dividen rápidamente si estás trabajando con cultivos celulares. Así que, pero permítanos .. Hagamos una comparación entre la suspensión de células maduras y la pared celular secundaria viene cuando la organogénesis y está en el tejido presente no es ... Puede haber la probabilidad de que la probabilidad puede ser alta. Por lo tanto, las células maduras es que hay una diferencia importante entre las células maduras andimmaduras. Si usted recuerda que yo estaba diciendo en las clases anteriores que las células más jóvenes el vacuolespresente son pequeñas, el citoplasma es más denso, por lo que la probabilidad es más alta. En las células maduras, los vacuoles se vuelven grandes el citoplasma es menos denso. Por lo tanto, más denso es el citoplasma más alto es la probabilidad de transformación. Por lo tanto, y más vacuas contienen enzimas que pueden degradar rápidamente el ADN extracelular. Por lo tanto, se prefiere que utilice células más jóvenes en comparación con las células maduras. En la literatura, usted findelas células que se utilizan o los tejidos utilizados varían de callo, todo tipo de cultivos in vitro pueden ser transformados, callo, células de la suspensión, protoplastos, luego tejido entero de todo el órgano de la planta así que si hay un amplio rango. Ahora, después de los explantes han sido co-cultivados con agrobacterium, cómo detectar que las células se transforman con éxito o no. Ya hemos leído ahora que con base en el marcador de selección o el sistema de marcadores presente, si es la base de la histoquímica que puede ser utilizado o Se puede utilizar el medio de selección de antibióticos o el medio de selección de herbicida para aumentar la probabilidad de que usted termine en células transformadas con éxito con subsecuente sub-cultivo. Aparte del marcador o del agente selectivo, la agrobacteria que inhibe el crecimiento de los compuestos que inhiben otros antibióticos como la solución salina de carbono a través de agrobacterium es sensible a la azafata. Por lo tanto, también se usa. ¿Por qué cree usted y cuándo se usa o cuándo debe usarse?Para la transformación, ¿qué está haciendo usted está trayendo a la agrobacterium en contacto cercano con las células, pero en última instancia, qué quiere usted transformar las células de la planta, usted no puede mantener el agrobacterium porque va a crecer más que posteriormente conducirá a la pérdida de la viabilidad de las células y del crecimiento. Así, después de la transformación exitosa, la cultura sucesiva tiene que ser quitada lejos de la agrobacteriumha de ser removed.Así, después de 48 horas, generalmente 48 horassis la línea de tiempo para la exposición con la agrobacterium, y entonces se mantiene en la alta concentración de la solución salina del carbono o cualquier antibiótico donde agrobbacterium sensible hacia. Por lo tanto, posteriormente con una concentración reducida del antibioticose mantiene sub-cultivo. Andafter subculturas subsecuentes el antibiótico se elimina del medio, porque el propio antibiotico puede ser inhibidor del crecimiento de la célula vegetal que usted no quisiera tener para las células transformadas. En general las células transformadas, porque hemos manipulado genéticamente a ellos, por lo que sus crecimientos se están comprometido.Así, el marcador de selección sistemas los niveles tóxicos, por lo que lo que tiene que ser optimizado el nivel de toxicidad del agente de selección es especies.Así, una especie específica el tiempo de exposición es la especie específico, la concentración de antibióticos es específica de las especies, por lo que tiene que ser optimizado.Por lo tanto, este es el protocolo completo Esto es para su referencia el protocolo teórico cómo es done.Así, lo que se hace es elegir un explants apropiado, a continuación, esterilizar la superficie de los explantes, los explants son traídos inyou groserum agrobacterium en suspensión durante 24 horas. Usted busca la fase de crecimiento porque entonces las culturas de agrobacterium son active.Así, generalmente las culturas de fase de registro son preferidas. Una vez que la agrobacterium ha crecido, existen diferentes cepas de agrobacterium que están presentes y que son virulentamente infectar las células de la planta, pero es muy altamente especiesdependent.Así, si uno agrobacterium como por ejemplo, agrobacterium LBA 4404 o 9402.Así, se trata de diferentes cepas que se sabe que son altamente virulentas, pero no es necesario que debido a que ha trabajado con una especie de planta, funcionará igualmente con la otra. Por lo tanto, es necesario elegir la cepa de agrobacterium crecer en fase activa, las células de fase de registro se utilizan. Entonces, incluso para exponer las células se puede utilizar diferentes técnicas. Lo que se necesita, o usted herida crear una herida en el explant y luego exponer la suspensión a la inmersión que el explant herido explant en la suspensión. Ahora, el tiempo de exposición también varía usted no puede Por lo tanto, generalmente de 10 a 15 minutos, usted lo mantiene expuesto, entonces usted necesita lavarlo, por lo que el exceso de crecimiento de agrobacterium no sucede cuando usted lo está manteniendo en la incubaciónpor 48 horas. Por lo tanto, usted necesita para usted puede variar el tiempo allí de la exposición el tiempo de exposición, puede variar la concentración de agrobacterium la concentración de autosuspensión. Usted puede tener diferencias cuando usted está usando la cultura para co cultivar con las células de la planta. Entonces usted puede variar el tipo de explant que puede ser variado. Entonces yo estaba hablando de que las heridas ahora mismo pueden ser creadas a través de diferentes.Así, la gente ha encontrado que el uso de una jeringa llena con la suspensión de agrobacterium, usted hace lesiones en la costilla media de los explantes de la hoja y que ha dado lugar a la eficiencia exitosa en la transformación. Entonces la gente utiliza el método de inmersión simple, donde exponen el explant herido por un bladeor por la creación de agujeros en las hojas o los explantes y luego Por lo tanto, hay diferentes factores que necesitan ser optimizados. Se ve fácil, pero hay un número de factores que necesitan ser optimizados para obtener una cultura transformada correctamente. Luego, en la transformación de planta generalmente utiliza el método de inmersión floral en el cual el flujo de agua se sumerge en la suspensión de agrobacterium, y luego se mantiene para la incubación de algún tiempo de que reside se dice que o bien las semillas mismas pueden ser esterilizadas en la superficie y sumergidas en la suspensión de tal manera que la agrobacterium puede transformar las semillas. Y una vez que se regeneran o cuando sale el semillero, la infeccion los tejidos, las partes aeriales o las regiones de la zona terrestre. O cuando las semillas, cuando las flores se sumergen con agrobacterium o se ponen en contacto con el agrobacterium justo antes de la polinización, durante la polinización o después de la polinización, el agrobacterium presente en el interior puede infectar el cigoto o puede infectar de primera mano las células germinales que van a getetah que participan en la formación de la cigoteformación. Estos son métodos de pulso largos de baja tensión significa que la duración del tiempo se incrementa, pero se utilizan frecuencias más bajas. Método de pulso corto de alto voltaje, por lo general se ha encontrado que los métodos de pulso corto de alto voltaje funcionan mejor que los métodos de pulso largos de baja tensión porque el daño al ADN es menor en ese caso.Ahora, lo que se hace el voltaje óptimo, por lo que lo que se puede optimizar el voltaje que weare usando el tiempo para el cual se está aplicando es optimizado. Entonces las frecuencias de transformación se incrementan varios pliegues añadiendo ciertas otras técnicas de choque térmico o ¿Por qué crees que ayuda?¿Han oído hablar de células competentes?¿Cómo se hacen competentes?Las células competentes significa que se vuelven más susceptibles a la absorción de los DNA.¿ Cómo se hacen susceptibles?Ha, cualquier divalente incluso el magnesio puede ser utilizado. ¿Cómo lo hace susceptible?Por lo tanto, aumentando así la proximidad entre el ADN extracelular y reduciendo la repulsión, porque ambos son cargados negativamente de modo que ese es el camino.¿Y qué pasa con el PEG, así que lo que hace?. Por lo tanto, lo que realmente está haciendo, todo lo que está facilitando ahora la absorción fácil. El polietilenglicol también se utiliza con mucha frecuencia. DMSO, polietilenglicol yeah. Reduce el. Entonces, lo que se hace es en los métodos químicos que estamos hablando de las células se hacen primero competente.Así, los iones divalentes pueden ser utilizados para reducir la repulsión de carga tal como para aumentar o aumentar la proximidad entre los dos DNA.La otra cosa es que hay un uso de la gente manipulan el pH, la gente addipolietilenglicolina el medio y la concentración del ADN también es manipulada para mejorar la eficiencia de la transformación.Ahora, algunos de estos métodos que usted necesita para volver y comprobar lo que hacen es, intentarán condensar el ADN o concentrar el DNA.Y concentrar el ADN reduciendo la proximidad entre el ADN extracelular y la membrana de la célula de la planta aumentaría la probabilidad de éxito, así que eso es lo que estas cosas do.Ahora, la infección de lipo son también la captación celular extra del ADN se puede mejorar encapsulándolos en la forma de liposomes.Ahora, la ingesta de liposomas es un fenómeno bien conocido en las células.Así, liposomas que no sólo aumentarán la absorción del ADN, sino que también protegerán el ADN de las nucleasas, así que así también helps.Ahora, lo que son liposomas, espero que usted sepa lo que son liposomas, son similares que tendrán ambos extremos hidrofóbicos hidrofóbicos. Ellos tener una doble capa. Al igual que la bicapa de fosfolípido. Y encapsularán el ADN con.Ahora, pueden ser inducidos a fusionarse con las células o el protoplasto usando PEG y por lo tanto, se pueden utilizar para la transferencia de genes. Entonces hay varias ventajas de lo que todas las diferentes ventajas con la infección de lipo, baja toxicidad celular, estabilidad y almacenamiento de ácido nucleico puede ser mejorado por la encapsulación, entonces alto grado de reproducibilidad y endocitosis es un fenómeno conocido ya presentin la célula, de modo que se puede tomar fácilmente por las células.Ahora, la precipitación de fosfato de calcio otro método de cloruro de calcio de cualquier manera está siendo usedif los fosfatos están presentes, entonces se condensa el ADN precipitados, el ADN tal que se condensa, reduce o permite que la célula traiga su mucho más cerca de la membrana celular, aumentando así la probabilidad de absorción de la DNA.Microinyección extracelular esto es transferencia directgene en la que se utiliza un conjunto de micro-inyección. No es tan fácil, uh bajo el microscopio usted sostiene la célula bien usando o por freezingit en una diapositiva, usando poli lisina. Poly lizinedebido a los cargos presentit tratará de pegarlo en un lugar, y la presión de rosca se crea de tal manera que no Y luego a través de ese conjunto de micro inyección, el ADN se intenta poner directamente a través de la membrana celular en el citoplasma o en el núcleo de la célula de la planta. Ahora, lo que otros métodos directos se pueden utilizar es en la literatura, usted verá que las personas han utilizado la fibra mediada la entrega de ADN en la que se utilizan las fibras nano de tamaño muy pequeño, las fibras de silicón se utilizan con alta velocidad, de modo que pueden impregnar la membrana del plasma en la válvula y el ADN se entrega en el citoplasma. A continuación, la entrega de ADN inducida por láser también se refiere. La jeringa de la que estábamos hablando, donde se puede inyectar directamente en el citoplasma o en el núcleo. Entonces micro proyectil que es su método de la pistola de genes en el cual a una velocidad muy alta, se puede entregar a las células de la planta o la tapa de los explantes bajo una atmósfera inerte con heliumgas. Y el vapor de agua usando la carga eléctrica bajo alta tensión, las gotas de agua de alta velocidad se crea, y lleva el ADN extracelular recubierto con los materiales inertes de tungsteno o nanopartículas de oro, que pueden ser inyectados bajo alta velocidad directlyinto los explantes.Me detengo aquí. Y luego la siguiente clase vamos a empezar con los reactores de la célula vegetal que es la última parte del curso.