Factor de transcripción

Hola a todo el mundo esto es Doctor Vishal Trivedi del departamento de biociencias y bioingeniería, IIT Guwahati. ¿Y en lo que estábamos discutiendo? Estábamos discutiendo acerca de la electroforesis y en este módulo en particular hemos discutido acerca de los fundamentos de la electroforesis seguido por la electroforesis en gel vertical, electroforesis en gel horizontal. Y luego en las conferencias anteriores, también hemos hablado de las diferentes variantes de la electroforesis en gel.
Y luego, en última instancia, también hemos discutido acerca de algunos de los problemas de investigación donde usted puede ser capaz de utilizar la electroforesis como una herramienta para responder a esas preguntas. Y en esta serie en particular hoy en día también vamos a discutir pocos experimentos más y pocos problemas de investigación más y mientras que discutir estos problemas de investigación, usted será capaz de entender más y más potencial de la electroforesis para resolver los problemas de investigación relacionados con su trabajo.
(Consulte la hora de la diapositiva: 02:04)

Así que el primer problema hoy en día lo que vamos a ver es, y este es un viejo problema lo que hemos discutido antes también que los científicos han descubierto un factor de transcripción, y en las células de la piel se une al conjunto del gen X que es responsable de cambiar su color debido a la exposición a la luz del sol. Ahora, les gustaría identificar el factor de transcripción de las células de la piel. Lo que quieren hacer es si usted recuerda en la conferencia anterior lo que hemos discutido que estaban interesados en identificar el factor de transcripción.
Y luego en la parte superior también están interesados en cómo el ADN, así como este factor de transcripción está interactuando entre sí Así como yo creo que se discutió que la estructura de genes está formada por el promotor y entonces usted tiene la región de codificación. Por lo tanto, esta región de codificación no es responsable de la vinculación del factor de transcripción. Sólo la región promotora es responsable de la unión del factor de transcripción y en este caso, lo que sucederá es que el ADN está haciendo un complejo con la proteína.
Y como resultado está formando un complejo de proteína de ADN. Ahora, si usted ve cómo es puede ser como esta interacción puede ser mapeada con la ayuda de la electroforesis? (Consulte el tiempo de la diapositiva: 03:34)

Así que en el diseño experimental lo que tenemos, tenemos las 2 moléculas. Uno es el ADN el otro es la proteína y lo que están haciendo es que interactúan entre sí para formar el Complejo de la proteína del ADN. Ahora suponemos que el ADN es del peso molecular de 1 unidad y la proteína también es de un peso molecular de la 1 unidad lo que significa que el complejo de proteína de ADN va a tener el peso molecular de 2 unidades.
Ahora, supongamos que el ADN si usted hace la electroforesis de estas 3 moléculas entonces la movilidad electroforética del ADN es X. La movilidad electroforética de Y es la proteína es Y entonces y el complejo de proteína de ADN es Z, entonces la pregunta viene si la X va a ser más grande a la Z o X va a ser la más pequeña a la Z lo que significa si el ADN va a ser más rápido que el ADN lo que está presente en el complejo o si el ADN lo que está presente se va a correr más lento que el ADN lo que está presente en el complejo.
Como obvio que el peso molecular del complejo de la proteína del ADN es más grande. Así que en realidad va a correr a un tamaño más lento, lo que significa que el ADN va a tener la mayor movilidad electroforética en comparación con el ADN lo que está presente en la proteína. Porque como se recuerda; que la movilidad electroforética en la electroforesis en gel es directamente proporcional al gráfico e inversamente proporcional al peso molecular.
Esto significa que tienes un peso molecular más pequeño, vas a correr más rápido y vas a tener una distancia más grande, cubriarás la distancia más grande donde como si tuvieras un peso molecular más grande entonces vas a correr las distancias más pequeñas.
(Consulte la hora de la diapositiva: 05:43)

Por lo que esta interacción de la proteína y el ADN se mapea con la técnica o con el ensayo que se llama como el ensayo de cambio de movilidad en gel. En esta técnica se basa en el hecho de que un pequeño

El ADN tiene una movilidad mucho más alta en electroforesis en gel y luego lo que está unido a la proteína. Así que lo que puedes ver es si estoy ejecutando la electroforesis o si estoy haciendo la electroforesis del ADN solo el ADN se extenderá hasta este punto. Pero si sigo añadiendo las moléculas de proteínas, las moléculas de proteínas son en realidad enlazadas a la proteína al ADN y como resultado en realidad está reduciendo su movilidad electroforética.
Ahora Imagina que el ADN lo que estás poniendo para la electroforesis es de 100 kilos Dalton, ok y la proteína lo que estamos poniendo es un Dalton de 25 kilos. Ahora ven cuando se está ejecutando el ADN solo, en realidad está teniendo un peso molecular de 100 kilos Dalton. Pero cuando se está añadiendo la pequeña cantidad de proteína es en realidad la molécula 1 de la proteína si la molécula de 1 de proteína está interactuando con el ADN, el peso molecular resultante va a ser de 125 kilos Dalton.
Del mismo modo si las 2 moléculas de la proteína interactuarán entonces va a tener el peso molecular de 150 kilo Dalton y si las 3 moléculas de la proteína van a interactuar, en realidad va a tener el Dalton de 170 kilos como un peso molecular. Esto significa que cada vez más moléculas de proteínas se unirán a esta molécula de ADN el peso molecular resultante del complejo va a ser cada vez mayor lo que significa que usted puede ser capaz de mapear la interacción entre las 2 moléculas simplemente mirando la masa molecular.
(Consulte la hora de la diapositiva: 07:38)

Entonces, ¿para realizar este experimento lo que se supone que debes hacer? Usted tiene que preparar primero el lisado de la célula que tiene que hacer las reacciones de incubación donde usted realmente va a incubar el

ADN más la proteína, ok y luego se va a hacer la electroforesis en gel de poliacrilamida, y eso en realidad le va a dar la resultante esa adición de las bandas de ADN.
(Consulte la hora de la diapositiva: 08:08)

Los materiales reactivos el material y el equipo lo que su requerido. Así que el primer reactivo lo que usted requiere es la etiqueta de las mezclas de reacción para que usted sea capaz de etiquetar el ADN. Porque, ¿cómo va a monitorear la migración de retraso de la molécula de ADN es que usted realmente va a etiquetar el ADN con un material radiactivo. Así que en este caso estamos usando los oligonucleótidos etiquetados P32.
Así que lo que vas a hacer es que vas a tomar los oligonucleótidos que vas a ejecutar los búferes de reacción de 10X PNK y luego vas a añadir la enzima que T4 polinucleotidos quinasa y luego vas a añadir las etiquetas alfa 32 ATP y el doble agua destilada. Y estas reacciones de etiquetado van a ser catalizadas y entonces en realidad va a etiquetar la molécula de ADN que es el oligonucleótido que usted va a utilizar en los ensayos de cambio de gel.
También necesita el almacenamiento intermedio de ensayo de enlace. Así que la composición del buffer de ensayo de unión se da aquí que en realidad contiene en su mayoría los amortiguadores, entonces usted tiene los agentes reductores y entonces usted tiene el EDTA para que usted debe cuidar de los metales contaminantes y todo eso y entonces usted necesita para resolver el buffer que usted va a utilizar para la ejecución de la página. Así que 5X TBE buffer donde vas a tener Tris, ácido bórico y EDTA y luego el volumen final lo que vas a hacer hasta el 1 litro.

Y luego necesitas preparar la receta para el gel de la página no desnaturalizante, así que donde vas a tomar la acrilamida, agua, TBE entonces APS y TEMED se van a añadir como los agentes de polimerización. Y entonces usted requeriría el sentido, así como los oligonucleótidos antisentido. Para que puedas diseñar los oligonucleótidos y luego en el instrumento lo que necesitabas necesitas sistema de electroforesis en gel y así como el microfugio.
Microfuge significa que usted requiere una pequeña centrífuga para que sea capaz de palpalar la mezcla de reacción. Esto se puede hacer en un multipaso.
(Hora de la diapositiva: 10:33)

Así que en el paso 1 se va a preparar la sonda etiquetada. Así que la sonda etiquetada puede ser preparada de múltiples maneras y que todo lo que vamos a discutir en detalle cuando vamos a discutir la mancha sur. Así que por el momento solo puedes simplemente entender que vas a añadir que vas a tomar el oligonucleótido que vas a añadir la radioactividad o radio etiquetada ATP.
Y entonces simplemente vas a añadir el PNK y eso en realidad va a catalizar las reacciones para añadir la ATP a los oligonucleótidos. Así que aquí vas a tomar el 2 oligonucleótido, uno es sentido oligonucleótido el otro es el antisentido onigonucleótido para que puedas ser capaz de diseñar un ADN de doble hebra. Así, por ejemplo, te han dado una secuencia del sentido y del oligonucleótido antisentido.

Así que este es el sentido de la hebra es la hebra antisentido que se puede utilizar y esta es la secuencia que realmente va a unirse o que va a facilitar la unión de la proteína. De modo que esa es la región que hay que mantener en el centro de esta secuencia particular. Para que sean una cantidad adecuada de nucleótidos estará disponible en ambos lados. De modo que la proteína podría ser capaz de encajar en la parte superior de esta secuencia en particular y será capaz de unirse muy bien.
Luego tienes que hacer el, sabes varios pasos de hacer las reacciones de etiquetado y luego en última instancia tienes que purificar el nucleótido etiquetado por la columna de filtración de gel usando las columnas G50. Y esta columna está preequilibrada con los búferes para que pueda eliminar el exceso de actividad de radio del nucleótido marcado por la radio. Así que una vez que su sonda etiquetada esté lista, entonces usted tiene que ir al paso 2.
(Hora de la diapositiva: 12:39)

Así que en el paso 2 tienes que configurar las reacciones, así que para el ajuste de las reacciones de unión lo que tienes que hacer es que tienes que tomar los extractos de proteína nuclear se incuban con la sonda etiquetada. Mientras se establecen las reacciones de unión, los siguientes componentes se añaden en el orden dado bajo la condición de frío de hielo. Así que esto es muy importante que hagas todos estos experimentos bajo las condiciones de baja temperatura.
De modo que no habrá degradación del ADN o tampoco habrá decoración de proteínas.
Porque cualquiera de estas degradaciones; van a comprometer los efectos globales. Así que lo que usted necesita es que usted necesita el ADN del esperma de Salmón que usted va a preparar en el agua tratada con DEPC.

Así que el agua tratada con DEPC es un agua que está libre del ARN para que no haya degradación del ARN.
Si en todo el ARN está presente porque eso en realidad va a enmascarar la señal lo que se va a obtener del ADN. A continuación, también necesita los almacenamientos intermedios de enlace para que la composición de los almacenamientos intermedios de enlace ya se haya dado la diapositiva anterior. Entonces hay que preparar los extractos nucleares.
Así que hay que añadir el X microlitro de extracto nuclear. Así que eso depende de qué tipo de actividad está presente en su muestra y todo eso.
A continuación, necesita la sonda etiquetada. Así que este extracto nuclear va a ser en realidad la fuente de la proteína porque el extracto nuclear va a tener el factor de transcripción. Para que te interese probar y luego tienes que maquillarte el volumen con el doble agua destilada. Así que después de la adición de todos los componentes sobre los ojos los tubos son espinados brevemente en microfuge para que usted pueda ser capaz de recoger todas las mezclas de reacción.
Y luego se incuban por 45 minutos a 25 grados centígrados para que haya interacción de los factores de transcripción, lo que está presente en el extracto nuclear con el oligonucleótido que es usted está añadiendo y entonces es en realidad va a formar el complejo. En esto habrá una variación que para el experimento del súper cambio. Así que los experimentos de super cambio son los experimentos en los que también se está interesado por lo que la proteína en la unión en realidad.
Así que en esos casos lo que puedes hacer es, simplemente puedes añadir los anticuerpos dirigidos contra un factor de transcripción particular para que puedas no saber solo que las proteínas son vinculantes pero también qué proteína es vinculante. Así que ese tipo de experimentos se llaman experimentos de super cambio. Debido a que en un cambio normal, el ensayo normal de cambio de gel lo que usted va a hacer es, usted va a ver un retraso gradual del ADN o el movimiento gradual del ADN en el lado hacia arriba.
Pero en el experimento del súper cambio tan pronto como se añadan los anticuerpos, los anticuerpos van a aumentar el peso molecular del complejo muy alto. Así que debido a eso en realidad le va a dar un cambio adicional en el retraso. Por lo tanto, el microgramo del anticuerpo respectivo se agrega a la reacción de unión antes de la adición de la sonda etiquetada. Por eso en realidad va a etiquetar o va a atar la proteína o el factor de transcripción de su interés.

Así que debido a eso en realidad te va a mostrar el súper cambio que significa en una cosa normal lo que tienes es, tienes un ADN aquí y entonces gradualmente crecerá en realidad. Mientras que en el súper cambio lo que sucederá es que tienes un ADN aquí y luego mostrará un salto muy grande en términos de cambio. Porque aquí; solo tienes la proteína mientras que aquí tienes la proteína así como el anticuerpo.
Así que en realidad va a aumentar el peso molecular en cantidades muy grandes. Así que en realidad se va a sumar mucho en cuanto al complejo final de ADN proteico lo que se va a formar. Por lo que esta mezcla se incubó durante 20 minutos y luego se agrega la sonda etiquetada y se lleva a cabo la incubación por otros 45 minutos. Así que la única diferencia entre un ensayo de cambio de gel normal, así como el ensayo de súper cambio es que hay que añadir anticuerpos antes de añadir el oligonucleótido.
Para que los anticuerpos vayan y se unan a su respectiva proteína objetivo y luego si esas proteínas van y se unen a su ADN en realidad van a mostrarles el súper cambio.
(Consulte la hora de la diapositiva: 17:20)

Luego el paso 3 hay que hacer el análisis de la reacción. Así que una vez que los períodos de incubación del análisis hayan terminado entonces lo que tienes que hacer es que tienes que tomar estas muestras y luego tienes que analizarlas en los geles de poliacrilamida no desnaturalizantes del 5%. En cada pozo, se puede resolver el microlitro 20 de la mezcla de reacción y monitorear el progreso del gel un tubo que contiene la sonda etiquetada sola junto con el tinte bromofenol azul se agrega en uno de los carriles.
Para que usted sea capaz de hacer usted será capaz de ver cuánto tiempo el ADN migrará si el componente de proteína no está disponible. Porque ese será su punto de referencia cuánto cambio de la banda de ADN que está recibiendo cuando usted está agregando los extractos nucleares. A continuación, el 5X TBE se utiliza como almacenamiento intermedio en ejecución. El gel se ejecuta en la constante de 50 voltios y se tiene que hacer en una condición fría para que no haya degradación del ADN.
Porque si habrá alguna degradación del ADN que también te va a dar una disminución gradual de la evidencia molecular por lo que eso también te va a dar una mera condición de mentira. Así que si habrá una degradación del ADN lo que sucederá es que el ADN estará aquí y entonces usted va a ver una gran cantidad de bandas en eso en realidad va a enmascarar las muestras reales de ADN. Incluso si usted tiene una muestra de ADN aquí, en realidad va a ser enmascarado por esa degradación de la sonda de ADN lo que usted ha agregado en esta mezcla de reacción.
Así que debido a eso, es importante que usted debe mantener el ADN en una condición muy estable. Y usted debe cuando incluso cuando usted está resolviendo las muestras y también debe resolverlo en una condición fría para que no habrá degradación. Después de completar la electroforesis, el gel se secó envolviéndola en el envoltorio de gel y se expone a una película sensible de rayos X durante 1 a 3 días.
La banda se puede ver después de desarrollar la película y se analiza densitometricamente usando el software de la imagen J.
Así que el análisis de la imagen de todos modos hemos discutido en un detalle. Para que pueda ser capaz de tener la imagen digital puede ser capaz de utilizar muchos software de lo que hemos discutido antes también.
Que sepas que o bien puedes usar la imagen J o cualquier otro software comercial lo que estén disponibles de las diferentes empresas.
(Hora de la diapositiva: 20:04)

Vamos a ver qué resultados va a ver así que en la sección de resultados de las radiografías de automóviles positivos muestra que los experimentos de enlace positivo que significa lo que se puede ver en un experimento típico que cuando se está ejecutando la sonda solo, en realidad va a correr en un muy lejos de su carril. Pero a medida que aumentas o como pones el extracto nuclear lo que sucederá es que la banda se va a seguir moviendo hacia la parte superior.
Lo cual; significa que las proteínas ahora son obligatorias en una cantidad muy baja y luego en última instancia toda la proteína está unida. Y lo que ves es en realidad habrá una separación que significa lo que ves es el tipo de la curva que significa en esta etapa todo el ADN, lo que has agregado en estado saturado por las proteínas que están presentes en el extracto nuclear. Ahora, ¿cómo puede ser capaz de verificar esto? Usted puede ser capaz de verificar esto mediante la adición de los oligonucleótidos fríos.
Entonces, ¿qué pasará si se agregan los nucleótidos fríos? El nucleótido frío va a compatibilizarse con la proteína lo que aquí se une. Y debido a eso en realidad va a liberar el oligonucleótido unido que es el oligonucleótido etiquetado. Así que lo que sucederá es que usted estará observando la banda en la parte inferior. Así que si usted va a formar los complejos de proteínas y luego si usted agrega el oligonucleótido frío.
Lo que significa el oligonucleótido frío es el oligonucleótido no etiquetado. De modo que el oligonucleótido no etiquetado va a compatibilizarse con el complejo y va a liberar la radio etiquetada como oligonucleótido. Y en ese proceso, se va a volver a ver la reaparición de la radio etiquetada como oligonucleótido. Debido a que la proteína está haciendo un complejo con el ADN le está dando el complejo de ADN de proteínas.
Pero si usted agrega la sonda que no es la radio etiquetada de modo que esta sonda es en realidad radio etiquetada, es por eso que usted tiene un complejo de radio etiquetado. Así que si usted agrega la sonda o el ADN que no es la radio etiquetada de modo que lo que sucederá es en que esta proteína va a ser fraccionato entre la sonda etiquetada versus la sonda no etiquetada. Así que en última instancia lo que sucederá es que va a empezar a formar el complejo con la sonda no etiquetada y la sonda etiquetada ahora va a ser liberada de las reacciones.
Y esta sonda etiquetada de nuevo va a ser electroforate o va a tener el tipo similar de movilidad electroforética lo que una sonda libre está teniendo. Así que es por eso que usted realmente va a ver la reaparición de la sonda etiquetada. Así que es una especie de una verificación de que esta es una interacción específica en la parte superior si usted está más interesado. Lo que puedes hacer también es que simplemente puedes bloquear los lados; lo que está presente en el ADN también con la ayuda de diferentes tipos de anticuerpos y en esos casos la proteína lo que vas a añadir no podrá interactuar.
Así que estas son las diferentes formas en las que vas a obtener el resultado y en las que podrás poder verificar los resultados. Así que con esto me gustaría concluir nuestra conferencia aquí en nuestra conferencia subsiguiente vamos a discutir algunos problemas más relacionados con la electroforesis.