Diseño experimental
Hola a todo el mundo esto es Doctor Vishal Trivedi del departamento de biociencias y bioingeniería de, IIT Guwahati. ¿Y en lo que estábamos discutiendo? Estábamos discutiendo acerca de la electroforesis dey en este módulo en particular hemos discutido acerca de los fundamentos de la electroforesis deseguido por la electroforesis en gel vertical, electroforesis en gel horizontal. Yentonces en las conferencias anteriores, también hemos discutido acerca de las diferentes variantes del gelelectroforesis.Y luego en última instancia también hemos discutido acerca de algunos de los problemas de investigación dondepuede ser capaz de utilizar la electroforesis como una herramienta para responder a esas preguntas. Y en esta serie deen particular ahora también vamos a discutir pocos experimentos más y pocos más problemas de investigación dey mientras discutimos estos problemas de investigación, usted será capaz de entendercada vez más potencial de la electroforesis para resolver los problemas de investigación relacionados con su trabajo de.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 02:04)
Así que el primer problema hoy en día lo que vamos a ver es, y este es un viejo problema lo que hemos discutidoantes también que los científicos han descubierto un factor de transcripción, y en las células de la pielse une al conjunto del gen X que es responsable de cambiar su color debido a la exposición a la luz del sol de. Ahora, les gustaría identificar el factor de transcripción de las células de la piel. Lo quequieren hacer es si usted recuerda en la conferencia anterior lo que hemos discutido que ellos estabaninteresados en identificar el factor de transcripción.Y luego en la parte superior también están interesados en cómo el ADN, así como este factor de transcripción esinteractuando entre sí Así que como yo creo que discutimos que la estructura de genes está formada por el promotor dey entonces usted tiene la región de codificación. Por lo tanto, esta región de codificación no es responsable del enlacedel factor de transcripción. Sólo la región promotora es responsable de la unión del factor de transcripcióny en este caso, lo que sucederá es que el ADN está haciendo un complejo conla proteína.Y como resultado está formando un complejo de proteína de ADN. Ahora, si ve cómo se puede ver cómoesta interacción se puede correlacionar con la ayuda de la electroforesis?(Consulte la hora de la diapositiva: 03:34)
Así que en el diseño experimental lo que tenemos, tenemos las 2 moléculas. Uno es el ADN el otroes la proteína y lo que están haciendo es interactuar entre sí para formar el Complejo de proteínas de ADN. Ahora vamos a suponer que el ADN es del peso molecular de 1 unidad y la
La proteína también es de un peso molecular de la unidad 1, lo que significa que el complejo de proteína de ADN esva a tener el peso molecular de 2 unidades.Ahora, supongamos que el ADN si usted hace la electroforesis de estas 3 moléculas entonces la movilidad electroforética de ADN dees X. La movilidad electroforética de Y es la proteína es Y entoncesy el complejo de proteína de ADN es Z, entonces la pregunta viene si la X va a ser más grandea la Z o X va a ser el más pequeño a la Z lo que significa si el ADN va a ser ejecutadomás rápido que el ADN lo que está presente en el complejo o si el ADN lo que está presente vaa ser ejecutado más lento que el ADN lo que está presente en el complejo.Como obvio que el peso molecular del complejo de proteína de ADN es más grande. Así que en realidad esva a funcionar con un tamaño más lento, lo que significa que el ADN va a tener la mayor movilidad electroforéticaen comparación con el ADN lo que está presente en la proteína. Porque como usted recuerda; que la movilidad electroforética deen la electroforesis en gel es directamente proporcional al gráfico yinversamente proporcional al peso molecular.Esto significa que tiene un peso molecular más pequeño, va a correr más rápido y va aa tener una distancia más grande, cubrirá la distancia más grande donde como si tuviera un peso molecular más grande deentonces va a correr las distancias más pequeñas.(Consulte la hora de la diapositiva: 05:43)
Por lo tanto, esta interacción de la proteína y el ADN se correlaciona con la técnica o con el ensayoque se llama como el ensayo de cambio de movilidad en gel. En esta técnica se basa en el hecho de que un pequeño
El ADN tiene una movilidad mucho más alta en electroforesis en gel y luego lo que está unido a la proteína. Así quelo que puedes ver es si estoy ejecutando la electroforesis o si estoy haciendo la electroforesis del ADN desolo el ADN se extenderá hasta este punto. Pero si sigo añadiendo las moléculas de proteínas, las moléculas de proteína deson realmente vinculantes para la proteína al ADN y como resultado es realmentereduciendo su movilidad electroforética.Ahora Imagina que el ADN lo que estás poniendo para la electroforesis es de 100 kilos Dalton, oky la proteína lo que estamos poniendo es un Dalton de 25 kilos. Ahora ven cuando se está ejecutando el ADNsolo, en realidad está teniendo un peso molecular de 100 kilos Dalton. Pero cuando usted está añadiendo lapequeña cantidad de proteína es en realidad la molécula 1 de la proteína si la molécula de 1 de proteína esinteractuando con el ADN, el peso molecular resultante va a ser de 125 kilos Dalton.Del mismo modo si las 2 moléculas de la proteína interactuarán entonces va a tener el peso molecularde 150 kilo Dalton y si las 3 moléculas de la proteína van a interactuar, en realidadva a tener el dalton de 170 kilos como un peso molecular. Esto significa que cada vez más moléculas de proteína dese unirán a esta molécula de ADN que el peso molecular resultante del complejova a seguir aumentando, lo que significa que puede ser capaz de mapear la interacción entre las 2 moléculas desimplemente mirando la masa molecular.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 07:38)
¿Así que para realizar este experimento lo que se supone que debe hacer? Usted tiene que preparar primero el lisado de célulasque tiene que hacer las reacciones de incubación donde realmente va a incubar el
ADN más la proteína, ok y luego usted va a hacer la electroforesis de gel de poliacrilamida,y eso en realidad le va a dar el resultado que la adición de las bandas de ADN.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 08:08)
El material reactivo el material y el equipo lo que necesita. Así que el primer reactivo lo quenecesitaste son las mezclas de reacción de etiquetado para que puedas etiquetar el ADN. Porque,cómo van a monitorear la migración del retraso de la molécula de ADN es que ustedrealmente va a etiquetar el ADN con un material radiactivo. Así que en este caso estamos usando los oligonucleótidos etiquetados P32.Así que lo que vas a hacer es que vas a tomar los oligonucleótidos que vas a ejecutar los búferes de reacción10X PNK y luego vas a añadir la enzima que T4 polinucleótidoquinasa y luego vas a añadir las etiquetas alfa 32 ATP y el doble agua destilada. Yesta reacción de etiquetado va a ser catalizada y entonces en realidad va a etiquetar la molécula de ADNque es el oligonucleótido que usted va a utilizar en los ensayos de cambio de gel.También necesita el buffer de ensayo de unión. Así que la composición del buffer de ensayo de enlace se daaquí que en realidad contiene principalmente los búferes, entonces usted tiene los agentes reductores y entonces ustedtiene el EDTA para que usted debe cuidar de los metales contaminantes y todo eso y luegousted necesita para resolver el buffer que usted va a utilizar para la ejecución de la página. Así que 5X TBEbuffer donde vas a tener Tris, ácido bórico y EDTA y luego el volumen final quévas a hacer hasta el 1 litro.
Y entonces usted necesita preparar la receta para el gel de la página no desnaturalizante, así que donde usted va atomar la acrilamida, el agua, TBE entonces APS y TEMED se van a añadir como los agentes de la polimerización de. Y entonces usted requeriría el sentido, así como los oligonucleótidos antisentido. Para que puedas diseñar los oligonucleótidos y luego en el instrumentolo que necesitabas necesitas sistema de electroforesis en gel y así como el microfugio.Microfuge significa que necesitabas una pequeña centrífuga para que puedas palar la mezcla de reacción de. Esto se puede realizar en un paso múltiple.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 10:33)
Así que en el paso 1 va a preparar la sonda etiquetada. Así que la sonda etiquetada se puede prepararde múltiples maneras y que todo lo que vamos a discutir en detalle cuando vamos a discutir eldel sur de la mancha. Así que por el momento usted puede simplemente entender que va a añadirque va a tomar el oligonucleótido que va a añadir la radioactividad o radio etiquetadaATP.Y entonces usted simplemente va a añadir el PNK y que en realidad va a catalizar las reacciones depara añadir la ATP a los oligonucleótidos. Así que aquí va a tomar el 2oligonucleótido, uno es el oligonucleótido de sentido el otro es el antisentido onigonucleótido tanque usted puede ser capaz de diseñar un ADN de doble hebra. Así, por ejemplo, le han dado una secuenciadel sentido y oligonucleótido antisentido.
Así que este es el sentido de la hebra es la hebra antisentido que se puede utilizar y esta es la secuenciaque en realidad va a unirse o que va a facilitar la unión de la proteína. Así que esla región que tienes que mantener en el centro de esta secuencia en particular. Para que seanla cantidad adecuada de nucleótidos estará disponible en ambos lados. Para que la proteína pueda sercapaz de encajar en la parte superior de esta secuencia en particular y será capaz de unirse muy bien.Entonces usted tiene que hacer el, usted sabe varios pasos de hacer las reacciones de etiquetado y luegoen última instancia usted tiene que purificar el nucleótido etiquetado por la columna de filtración de gel usando las columnas G50. Y esta columna está preequilibrada con los almacenamientos intermedios para que pueda eliminarel exceso de actividad de radio del nucleótido marcado por la radio. Por lo tanto, una vez que el analizador etiquetado esté listo,tendrá que ir al paso 2.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 12:39)
Así que en el paso 2 tienes que configurar las reacciones, así que para el ajuste de las reacciones de enlace lo queque tienes es que tienes que tomar los extractos de proteínas nucleares se incuban con la sondaetiquetada. Mientras se establecen las reacciones de enlace, los siguientes componentes se añaden en la ordendada bajo la condición de frío de hielo. Así que esto es muy importante que hagas todos estos experimentosbajo las condiciones de baja temperatura.Para que no haya degradación del ADN o no habrá decoración de proteína también.Porque cualquiera de estas degradaciones; van a comprometer los efectos generales. Así que lo quenecesita es que usted necesita el ADN del esperma de Salmón que usted va a preparar en el agua tratada con DEPC.
Así que el agua tratada con DEPC es un agua que está libre del ARN para que no haya degradacióndel ARN.Si en todo el ARN está presente porque realmente va a enmascarar la señal de lo que vaa obtener del ADN. A continuación, también necesita los almacenamientos intermedios de enlace para que la composición de los almacenamientos intermedios de enlace deya se haya dado la diapositiva anterior. Entonces hay que preparar los extractos nucleares.Así que hay que añadir el X microlitro de extracto nuclear. Por lo tanto, depende de qué tipo de actividad estépresente en el ejemplo y de todo ello.Entonces necesita la sonda etiquetada. Así que este extracto nuclear va a ser realmente la fuente de la proteínaporque el extracto nuclear va a tener el factor de transcripción. Para que estésinteresado en probar y luego tienes que maquillarte el volumen con el doble agua destilada. Así quedespués de la adición de todos los componentes sobre los ojos los tubos son espinosos brevemente enmicrofuge para que pueda ser capaz de recoger todas las mezclas de reacción.Y luego se incuban durante 45 minutos a 25 grados centígrados para que haya interacciónde los factores de transcripción, lo que está presente en el extracto nuclear con el oligonucleótido quees usted está añadiendo y entonces es en realidad va a formar el complejo. En esto habrá una variaciónque para el experimento de súper cambio. Así que los experimentos de super cambio son los experimentosdonde están también están interesados que la proteína en la unión en realidad.Así que en esos casos lo que puedes hacer es, simplemente puedes añadir los anticuerpos dirigidos contra un factor de transcripción particular depara que puedas no saber sólo que las proteínas son de enlacepero también qué proteína es vinculante. Así que ese tipo de experimentos se llaman experimentos de super shift. Debido a que en un cambio normal, el ensayo normal de cambio de gel lo que usted va a hacer es, ustedva a ver un retraso gradual del ADN o el movimiento gradual del ADN en el lado dehacia arriba.Pero en el experimento de súper cambio tan pronto como se agregan los anticuerpos, los anticuerpos van aaumentar el peso molecular del complejo muy alto. Así que debido a que en realidad va adarle un cambio adicional en el retraso. Por lo tanto, el 2 microgramos del anticuerpo respectivo esagregado a la reacción de unión antes de la adición de la sonda etiquetada. Por esorealmente va a etiquetar o va a vincular la proteína o el factor de transcripción de su interés.
Así que debido a eso en realidad te va a mostrar el súper cambio que significa en una cosa normallo que tienes es, tienes un ADN aquí y luego gradualmente crecerá en realidad. Mientras que en elsuper cambio lo que sucederá es que tienes un ADN aquí y luego mostrará un salto muy grande en términos de cambio de. Porque aquí, usted tiene sólo la proteína, mientras que aquí tiene la proteína tan biencomo el anticuerpo.Así que en realidad va a aumentar el peso molecular en cantidades muy grandes. Así que serárealmente va a sumar mucho en términos del complejo final de ADN de proteínas lo que va a serformado. Así que esta mezcla se incubó durante 20 minutos y luego se agrega la sonda etiquetada y la incubación deestá llevando a cabo otros 45 minutos. Por lo tanto, la única diferencia entre un ensayo de cambio de gelnormal, así como el ensayo de súper cambio es que hay que añadir anticuerpos antes de añadir el oligonucleótido de.Para que los anticuerpos vayan y se unan a su proteína objetivo respectiva y luego si esas proteínasse van y se unen en su ADN, en realidad le van a mostrar el cambio de super.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 17:20)
A continuación, el paso 3 tiene que hacer el análisis de la reacción. Así que una vez que la incubación del análisislos períodos se han terminado entonces lo que tienes que hacer es que tienes que tomar estas muestras y luego tienes queanalizarlas en el 5% de geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. En cada pozo, puede usted puederesolver el microlitro de 20 de la mezcla de reacción y monitorear el progreso del gel en un tubo
La que contiene la sonda etiquetada sola junto con el color azul bromofenol se añade en uno de los carriles.Para que pueda hacerlo, podrá ver cuánto tiempo migrará el ADN si el componente de proteínano está disponible. Porque ese será su punto de referencia cuánto cambio dela banda de ADN que está recibiendo cuando usted está agregando los extractos nucleares. A continuación, el 5X TBE esutilizado como almacenamiento intermedio en ejecución. El gel se ejecuta en la constante de 50 voltios y tiene que ser hecho en una condición fría depara que no haya degradación del ADN.Porque si habrá alguna degradación del ADN que también te va a dar una disminución gradual deen evidencia molecular para que también te vaya a dar una mera condición de mentira. Así que si allíserá una degradación del ADN lo que sucederá es que el ADN estará aquí y entonces usted va aver muchas bandas en eso en realidad va a enmascarar las muestras reales de ADN. Incluso si usted tiene una muestrade ADN aquí, en realidad va a ser enmascarado por esa degradación de la sonda de ADNlo que usted ha agregado en esta mezcla de reacción.Así que debido a eso, es importante que usted debe mantener el ADN en una condición muy estable. Ydebe cuando incluso cuando está resolviendo las muestras y también debe resolverlo en una condición defría para que no haya degradación. Después de completar la electroforesis, el gel se secóenvolviéndola en el envoltorio de gel y se expone a una película sensible de rayos X durante 1 a 3 días.Band se puede ver después de desarrollar la película y se analiza densitometricamente utilizando el software de imagen J.Así que el análisis de la imagen de todos modos hemos discutido en un detalle. Para que pueda tener la imagen digital de, puede utilizar muchos programas de software de lo que hemos discutido antes también.Que sepa que puede utilizar la imagen J o cualquier otro software comercial que esté disponiblede las diferentes empresas.(Consulte la hora de la diapositiva: 20:04)
Veamos qué resultados va a ver en la sección de resultados en la sección de resultados positivoslas radiografías demuestra que los experimentos de enlace positivo que significa lo que se puede ver en un experimento típico deque cuando se está ejecutando la sonda solo, en realidad se va a ejecutar en un muymuy lejos de su carril. Pero a medida que aumentas o como pones el extracto nuclear lo que sucederáes que la banda se va a seguir moviendo hacia el lado superior.Lo cual; significa que las proteínas ahora son vinculantes en una cantidad muy baja y luego, en última instancia, toda la proteínaestá unida. Y lo que usted ve es en realidad habrá una separación que significa lo que ustedve es el tipo de la curva que significa en esta etapa todo el ADN, lo que usted ha añadido enha sido saturado por las proteínas que están presentes en el extracto nuclear. Ahora, ¿cómo puedeverificar esto? Usted puede ser capaz de verificar esto agregando los oligonucleótidos fríos.Entonces, ¿qué pasará si usted agrega los nucleótidos fríos? El nucleótido frío va a compatibilizarcon la proteína lo que está atado aquí. Y debido a eso en realidad va a liberar el oligonucleótido deunido que es el oligonucleótido etiquetado. Así que lo que sucederá es que usted seráseguir observando a la banda en el fondo. Así que si usted va a formar los complejos de proteínas yentonces si agrega el oligonucleótido frío.Lo que significa el oligonucleótido frío es el oligonucleótido no etiquetado. De modo que el oligonucleótidono etiquetado va a compatibilizarse con el complejo y va a liberar la radio etiquetada como oligonucleótido de. Y en ese proceso, se va a volver a ver la reaparición del
radio etiquetada como oligonucleótido. Debido a que la proteína está haciendo un complejo con el ADN está dando austed el complejo de ADN de proteína.Pero si usted agrega la sonda que no es la radio etiquetada de modo que esta sonda es en realidad radio etiquetada, que espor qué usted tiene un complejo de radio etiquetado. Así que si usted agrega la sonda o el ADN que no es radioetiquetado de modo que lo que sucederá es en que esta proteína va a ser fraccionato entre la sondaetiquetada versus la sonda no etiquetada. Así que en última instancia lo que sucederá es que va a empezar a formarel complejo con la sonda no etiquetada y la sonda etiquetada ahora va a ser liberada de las reacciones de.Y esta sonda etiquetada va a ser de nuevo electroforate o va a tener el tipo similarde movilidad electroforética lo que una sonda libre está teniendo. Así que es por eso que en realidad va aver la reaparición de la sonda etiquetada. Por lo tanto, es una especie de verificación de que se trata de una interacciónespecífica en la parte superior si está más interesado. Lo que puedes hacer también es que simplemente puedes bloquearlos lados; lo que está presente en el ADN también con la ayuda de diferentes tipos de anticuerpos yen esos casos la proteína lo que vas a añadir no podrá interactuar.Así que estas son las diferentes formas en las que vas a obtener el resultado y en las que puedes sercapaz de verificar los resultados. Así que con esto me gustaría concluir nuestra conferencia aquí en nuestra conferencia posterior devamos a discutir algunos problemas más relacionados con la electroforesis.