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    Cuestiones científicas

    Hola a todo el mundo esto es Doctor Vishal Trivedi del departamento de biociencias y bioingeniería IIT Guwahati. ¿Y qué estábamos discutiendo? Estábamos discutiendo acerca de la electroforesis, así que en el módulo anterior hemos discutido sobre los diferentes aspectos de la electroforesis vertical la electroforesis en gel horizontal. Y luego tenemos en la conferencia anterior también hemos hablado de las diferentes combinaciones de la electroforesis vertical, así como de la horizontal.
    Para que puedas entender y abordar los diferentes tipos de problemas relacionados con el, y entender un proceso en particular. Y también le hemos mostrado cómo puede utilizar los diferentes geles de electroforesis verticales o horizontales para responder a las diferentes preguntas. Ahora en la conferencia de hoy vamos a discutir acerca de los problemas científicos que usted va a manejar cuando usted va a cómo resolverlos y cómo resolver los diferentes tipos de problemas y cómo usted puede ser capaz de utilizar los diferentes tipos de operadores de electroforesis?

    Así que cuando hablamos de electroforesis uno es seguro que el en el caso de la electroforesis en gel es en realidad utiliza las 2 diferentes técnicas principales o las principales propiedades de una molécula. Lo que significa que la electroforesis va a explotar la carga por la proporción de masa o en realidad va a separar la molécula basada en las masas. Cargo si la molécula se ha separado en función de la carga por proporción de masa, lo que significa que el proceso va a ser sensible a ser interacciones electrostáticas.
    Lo que significa que la electroforesis puede ser utilizada para mapear las interacciones donde la interacción electrostática está jugando los papeles principales. Si realmente está impartiendo los cargos positivos a las moléculas o si está impartiendo a la carga negativa a las moléculas o si los cargos positivos y negativos se están uniendo y formando los complejos. Este tipo de preguntas se pueden abordar porque la electroforesis en realidad considera la carga por la proporción de masa como uno de los criterios para separar las moléculas.
    Así que usted puede imaginar que una molécula no está cargada, pero si usted hace alguna actividad o algún proceso debido a eso si la molécula está realmente preguntando los cargos positivos o negativos. Entonces esto, particularmente las moléculas cargadas positivamente pueden ser separadas de las moléculas neutras o viceversa que usted tiene una molécula cargada positivamente y en realidad está cambiando en una molécula cargada negativamente.

    ¿Qué significa si usted tiene una mezcla, por ejemplo, si usted está añadiendo una enzima como la proteína (()) (04:00) o PKC entonces qué va a pasar? Si usted tiene una molécula cargada positivamente, en realidad va a impartir una carga negativa. Así que si usted quiere monitorear la actividad de la PKC lo que usted puede hacer es usted puede simplemente tomar la mezcla completa SA que realmente va a contener el sustrato de carga positiva el PKC y entonces usted puede agregar la ATP que en realidad va a ser el (()) (04:27) agente.
    Otro resultado en realidad va a generar el sustrato cargado negativamente por lo que como resultado si usted toma toda esta mezcla y se carga en la página horizontal o el gel de agarosa horizontal. El positivo irá hacia los electrodos negativos y el negativo irá hacia el electrodo positivo. Y así es como puedes ser capaz de decir cuantitativamente que de 100 moléculas cuántas moléculas se cargan negativamente y cuántas moléculas se cargan positivamente.
    De manera similar la electroforesis también va a ser considerada la masa lo que significa que también separa la molécula basada en la masa donde es por ejemplo cuando usted está agregando el SDS en la electroforesis. La carga se está utilizando y entonces las moléculas sólo se van a separar en función de la masa, lo que significa que realmente le va a decir el cambio en la masa o el cambio en el tamaño de la molécula.
    Tenemos 2 ejemplos en los que en realidad le va a decir el cambio en el tamaño, por ejemplo, si usted tiene una sola proteína y si usted hace alguna actividad y en realidad va a adquirir proteínas de adición o tiene monómero que en realidad se está convirtiendo en dímero de este tipo de cosas puede ser entendido o puede ser abordado simplemente mediante el uso de la electroforesis. El suplente es donde no van a ser cambio de masa pero en realidad va a cambiar la movilidad electroforética de esa molécula en particular por el cambio en la fricción de esa molécula es que si la molécula también va a cambiar su forma.
    Por ejemplo, si usted tiene un objeto de forma circular y que realmente se convierte en un objeto pentagonal estos, el área de superficie de esta molécula va a ser más pequeña en comparación con la superficie de estas moléculas o se cambiarán en la superficie de estas 2 moléculas. Y uno de los ejemplos clásicos es que si en realidad se monitorea la proteína que se desarrolla por ejemplo si se comienza con un monómero sigue siendo, 40 Kda.

    La proteína desplegada también es de 40 Kda, pero el tamaño de la proteína plegada va a ser menor en comparación con el tamaño de las proteínas desplegadas. De modo que también se puede monitorizar con la ayuda de la página nativa o la página de urea. Así que estos son los 2 aspectos principales de lo que se puede explotar cuando se está diseñando un experimento considerando la electroforesis en la imagen. Así que van a discutir diferentes tipos de experimentos en los que o bien vamos a explotar la carga por masa como criterio o algunos lugares también vamos a explotar los criterios de la masa.
    (Consulte la hora de la diapositiva: 07:24)

    Así que nuestro problema de investigación 1 es que donde tenemos el ir a la pregunta es que la mycobacterium Tuberculosis H37RV fue tratada con un medicamento y provoca la aparición de una nueva proteína X dentro de las células bacterianas. Ahora los estudiantes de doctorado, quieren determinar el peso molecular de las proteínas de la tuberculosis micobacteriana H37RV. Lo que significa que estás haciendo a un tratamiento a la célula y que en realidad está reduciendo específicamente la proteína X y lo que el estudiante quiere saber es cuál es el peso molecular; de estas proteínas particulares.
    ¿Y cómo hacer eso que usted puede hacer simplemente por el diseño en un experimento adecuado porque aquí lo que usted va a hacer? En realidad, usted quiere saber el peso molecular de la proteína y así es como usted puede ser capaz de utilizar la electroforesis. Vamos a ver cómo hacer eso? (Consulte el tiempo de la diapositiva: 08:30)

    Así que en el diseño experimental lo que vas a hacer es que solo puedes tomar las células MTb de acuerdo y lo que haces es que primero lo trates con el medicamento. Y luego, después de eso, usted realmente va a preparar este lisado de células y el lisado de células está realmente conteniendo la proteína de su interés que es la proteína X en este caso. Y entonces lo que haces es que resuelvas esto en una página de SDS porque quieres saber sólo la forma molecular.
    No desea conocer el peso molecular nativo o el peso en ese caso en ese caso lo que hace es ejecutar la página de SDS. Y en la página de SDS también debe ejecutar el marcador de peso molecular bien en el lateral para que realmente le ayude a saber en qué posición va a obtener lo que el peso molecular y luego haría es usted hacer el análisis de la imagen de gel con la ayuda de algunos de este software.
    Si recuerdas en el módulo anterior también hemos discutido cómo hacer el análisis de la imagen y cómo determinar la concentración de una proteína en particular y cómo determinar el peso molecular también. Así que ahora lo que haces es que analizaste un cuadro de gel. Así que estas son las cosas que tienes que hacer primero tienes que preparar el Lysate celular entonces tienes que preferir realizar la página de SDS. Y luego una vez que hayas hecho con una página de SDS, entonces puedes dibujar una curva de calibración.
    La curva de calibración es para ver cuál es la forma en que el gel está realmente resolviendo los diferentes tamaños del peso molecular de las proteínas. Y que en realidad la curva de calibración se puede utilizar para determinar el peso molecular de la proteína desconocida. Veamos cómo hacerlo.

    (Hora de la diapositiva: 10:38)

    Entonces, ¿qué hemos hecho? En el paso 1 hemos hecho la página de SDS así que lo que hemos hecho en realidad hemos resuelto la proteína de su interés, lo que significa que la proteína que usted está interesado para identificar el peso molecular o que usted está identificado y desea saber el peso molecular junto con que también hemos ejecutado el marcador de peso molecular. Por lo tanto, los marcadores son la mezcla comercialmente disponible de las proteínas que en realidad tienen los diferentes tipos de proteína.
    Y para estas todas estas proteínas su peso molecular ya se sabe ahora lo que tienes que hacer es en el paso 2 vas a hacer el cálculo de la movilidad relativa. La movilidad relativa se define como la migración de la proteína del carril versos la migración de los dados de seguimiento. Así que lo que puedes hacer es primero que determines la posición del trote de seguimiento para que realmente vaya a ser la distancia d lo que vas a poner.
    Y luego podrás poder determinar las distancias de todas y cada una de las bandas del molecular de los marcadores y es así como puedes tener la relativa movilidad de todas y cada una de las bandas. Y cuando se está mirando una banda en realidad se ve que esta banda es en realidad un poco más gruesa de lo que se espera. Así que en ese caso lo que tienes que hacer es simplemente tomar el medio del punto y de aquí tienes que calcular la distancia

    El enfoque final es que puedes hacer una 3 medición puedes hacer la una medición desde este punto uno puedes hacer otra medición desde este punto y puedes hacer la tercera medición desde el centro de la banda. Y es que en realidad puedes conseguir el d1 + d2 + d3 y dividido por 3 y que en realidad te va a dar la media distancia. Y promedio d ese promedio d se puede utilizar para todas y cada una de las bandas que en realidad va a cuidar de los errores lo que usted va a tener.
    Porque si usted toma el punto más bajo su valor Rf va a estar en el lado superior si usted toma el valor superior que va Rf valor va a ser en un lado más pequeño. Así que así es como para obtener un error mínimo lo que puedes hacer es que sólo puedes tomar los dos valores y entonces puedes tomar el promedio de eso y eso es en realidad va a ser la manera más apropiada de hacerlo. Así que una vez que hayas hecho el valor Rf para d1, d2, d3, d4 y d5 vas a obtener los valores de Rf de las proteínas individuales y entonces lo que puedes hacer es en el paso 3 en realidad puedes ser capaz de dibujar una curva de calibración entre el Rf versus el peso molecular del log.
    (Consulte la hora de la diapositiva: 13:27)

    Por lo tanto, utilizando esto puede trazar el peso molecular del registro en el eje y frente a la movilidad relativa en el eje x de la norma. Entonces, ¿qué vas a conseguir? Usted va a tener una curva negativa y le va a dar la ecuación que va a seguir la pregunta de y = mx
    + c. Así que el uso de las ecuaciones de regresión lineal usted puede ser capaz de estimar la masa de la proteína desconocida.

    Así que por ejemplo si usted tiene la ecuación de mx + c donde el valor x es lo que realmente requiere, así que si usted sabe el valor y puede ser capaz de determinar el valor x porque todos los demás son constantes y m también puede ser capaz de calcular a partir de este gráfico. Y como resultado usted será capaz de determinar la proteína que el enfoque de atleta es que dibuje una perpendicular y que perpendicular dondequiera que los golpes perpendiculares a esta curva en realidad se puede obtener el valor de x.
    Y como este es un registro se puede hacer un antilog de ese valor y ese valor de x va a dar el peso molecular de la proteína de su interés. Así que este es el método simple de determinar el peso molecular de la proteína que utiliza la página SDS ahh lo que también se puede combinar con este análisis es que. Porque si usted determina el peso molecular y usted puede ser capaz de determinar este peso molecular subunidad.
    Pero si usted está interesado y desea seguir explorando el sobre el estado oligomérico de esta proteína en particular, entonces lo que usted puede hacer es usted puede la ejecución del tipo similar de proteínas en una página nativa. Y entonces usted puede ser capaz de determinar el estado oligomérico que vamos a discutir en la diapositiva siguiente.
    (Hora de la diapositiva: 15:29)

    Así, cómo determinar el estado oligomérico de la proteína se puede usar la electroforesis en gel de poliacrilamida para determinar el estado oligomérico de la proteína. Una muestra de proteína se puede ejecutar bajo la desnaturalización, así como en la condición nativa en los 2 geles separados. Una proteína del peso molecular conocido se ejecuta tanto en el gel como luego usted va a hacer un cálculo de Rf para la proteína estándar como acabamos de discutir.
    Se puede extraer una curva de calibracion desde el gel nativo asi como el gel desnaturalizante y se utiliza para determinar el peso molecular de esa proteina particular bajo la condicion nativa asi como las condiciones de desnaturalizacion. El estado oligomérico de la proteína se calcula a partir de la fórmula el estado oligomérico es equivalente al peso molecular de la proteína lo que va a obtener de la página nativa dividida por el estado oligomérico lo que va a obtener de la página de SDS.
    Así que el proceso sigue siendo el mismo excepto que usted podría tener que ejecutar la misma muestra en los 2 geles uno es gel nativo donde no va a añadir el SDS o la beta (()) (16:40). Y luego tú también, yendo a correr geles adicionales donde vas a ejecutar la proteína bajo las condiciones de desnaturalización. Ahora usted tiene que ejecutar los marcadores, así que las proteínas marcadoras también son muy diferentes cuando se ejecuta para la página nativa frente a la página de SDS.
    Así que la proteína marcadora lo que le he mostrado ahora es sólo para la página de SDS así que entonces lo que usted exactamente el mismo usted va a calcular el valor de Rf de la proteína estándar. Usted va a dibujar la vibración de la proteína estándar en la condición de la página nativa, así como la página de SDS. Y entonces usted va a determinar el peso molecular de esta proteína en particular bajo la condición nativa, así como las condiciones de desnaturalización.
    Y entonces lo que vas a hacer es que vas a calcular el estado oligomérico simplemente dividiendo el peso molecular lo que vas a obtener de las condiciones nativas frente al SDS. Lo único que tienes que preocuparte es o de lo que no tienes demasiada preocupación es que imagina que tienes el peso molecular nativo o bien 46 bien. Y luego tienes un peso molecular SDS como 25 bien.
    Ahora si tengo que calcular el estatus oligomérico lo que haré es? Voy a dividir el 46 dividido por 25 que en realidad va a ser menor que el 2 que en realidad va a menos de 2 porque lo ideal sería 50 o esto debería haber sido 23. Pero como usted sabe que el estado oligomérico es un número perfecto no puede ser 1,75 o 2,25 o cualquier otro número. Puede ser

    bien 1 puede ser 2 puede ser 3 puede ser 4 no puede ser un número medio por lo que sea cual sea el número que usted consigue tiene que llegar a la siguiente figura redonda.
    Por ejemplo, si usted está recibiendo un 1,75 que puede hacer 2 si usted consigue el 1.2 entonces usted puede hacer 1 así que es la manera en que esa es la comprensión general que usted tiene que adoptar si usted quiere determinar el estado oligomérico en una manera más y más perfecta de hacerlo. Debido a que el estado oligomérico no puede ser un número parcial, puede ser un número entero. Ahora vamos a pasar al siguiente problema.
    (Hora de la diapositiva: 19:04)

    Así que el siguiente problema es el problema de la investigación que hemos discutido antes también y donde si usted recuerda cuando estábamos discutiendo acerca de la cromatografía de filtración de gel hemos tomado el mismo problema. Y ahora lo que voy a hacer es que voy a tomar el mismo problema, pero en lugar de usar la cromatografía de filtración de gel ahora voy a usar la electroforesis. La proteína X está presente en 3 estados oligoméricos; Monómero, Dimer y Tetramer. Ahora científico, quiere estudiar la estabilidad de la proteína.
    Así que usted sabe que la proteína nativa está parcialmente doblada que en realidad forma una estructura compacta cuando usted las expresa al agente desnaturalizante para realmente inicialmente obtiene la proteína parcialmente desdoblada cuando aumenta las condiciones de desnaturalización más adelante, entonces reduce el que se vuelve la estructura se vuelve ligeramente más suelta y al final de la muy alta consideración del agente desnaturalizador la proteína se desenvuelve completamente.

    Y esto en realidad forma la confirmación extendida, lo que significa que el radio de esta estructura en particular va a ser muy grande en comparación con las proteínas nativas.
    (Hora de la diapositiva: 20:25)

    Así que ahora, cómo resolver esto se puede ejecutar una página de urea para abordar o para estudiar estos complejos y se estudia este proceso de desarrollo de proteínas en particular. Así que en un experimento típico de desarrollo la proteína se expone a la diferente concentración de la urea. Y luego el cambio estructural en la proteína puede ser monitoreado por la técnica espectroscópica o de filtración en gel. El desarrollo de la proteína causa un aumento en el volumen hidrodinámico de la proteína y resulta en la movilidad más lenta en los geles de poliacrilamida. ¿Por qué es así?
    Porque una vez que el volumen hidrodinámico aumentará realmente va a experimentar la fricción más grande y más grande por lo que es como se va a aumentar el componente de fricción y es así como se va a comprometer la movilidad y por eso va a correr a un ritmo más lento. En la página de urea se prepara un gel de poliacrilamida con el gradiente horizontal de urea que es de 0 a 8 molares. La misma muestra de proteínas se carga en el carril diferente y se deja correr verticalmente perpendicular al gradiente de urea.
    Lo cual; significa que usted va a mantener un gradiente de urea a través del gradiente horizontal verticalmente aceptable de este lado a este lado. Así que este lado vas a tener el 0 y este lado vas a tener 8 molares urea y luego vas a resolver las muestras de proteínas en cada carril correspondientes a cada consulta de urea. Como la muestra corre en diferentes carriles se expone a la consulta diferente de la urea y en consecuencia a una particular consulta de urea la proteína se desdobla con el aumento en el volumen hidrodinámico.
    Entonces, ¿qué va a pasar? Cuando usted está comenzando los experimentos todos, la muestra se verá igual, excepto que vamos a obtener el expositor de la diferente cantidad de urea, Entonces, ¿qué pasará? (Consultar Tiempo de Slide: 22:23)

    Las muestras desdobladas de la muestra de proteína desplegada migrarán más lentamente debido al aumento de las fuerzas de fricción y da un patrón de marca de proteína único para proporcionar información cualitativa o semi-cuantitativa sobre el intermedio plegable de proteína. Entonces, ¿qué va a pasar? Cuando las proteínas se cargan en estos pozos y se les permite migrar mientras se están ejecutando, en realidad están siendo expuestos a la consulta diferente de la urea.
    Así que se puede imaginar que hasta el 4 molar urea la proteína, sigue manteniendo una estructura nativa por lo que es por eso que la migración es muy rápida. Pero como la proteína se está moviendo hacia el 5, 6 y toda esa alta consulta de la urea la proteína se está desarrollando. Y en esta etapa la proteína se desarrolló completamente porque como se desarrollará en realidad va a experimentar un alto consultor de la fuerza de fricción.
    Entonces, debido a que en realidad va a oponerse a la migración dentro de los geles de acrilamida y como resultado de ello su migración será más lenta y lenta y esa desaceleración va a ser en realidad proporcional al aumento del volumen hidrodinámico. Y eso en realidad se puede mapear para dibujar el semi cuantitativo, así como la información cualitativa. Cuando la proteína se va a desplegar cuando la proteína va a ser desnaturalizada y cuando su proteína es estable para que la información pueda ser utilizada para determinar la estabilidad relativa de las 2 proteínas o incluso los diferentes componentes de una proteína.
    Porque si los diferentes componentes de la proteína tienen la estabilidad diferente lo que usted verá es que se desdoblará entonces queda entonces se opone a la entonces se opone a la resistencia hacia los agentes desnaturalizantes y luego finalmente de nuevo se desdobla. Entonces, así es como se puede obtener un (()) (24:28) comportamiento en el que realmente se va a desplegar es como este derecho? En realidad se va a seguir siendo nativo entonces se desarrolló entonces va a quedar así.
    Entonces en el desdoblamiento así que en realidad puede dar los múltiples pasos en el plegado y que en realidad dirá que la proteína como las regiones múltiples que en realidad van a ser dobladas en una cinética diferente que se desarrolla y su estabilidad también es diferente para los agentes desnaturalizantes. La información de la página de urea de gradiente necesita una mayor verificación de las otras técnicas analíticas.
    Además de la página de urea plegable de proteínas también se puede utilizar para analizar los complejos de proteínas, así como la heterogeneidad covalentemente de las proteínas. Así que cada técnica cuando se realiza la técnica que no es lo suficientemente buena o no es absoluto por su cuenta. Por eso es por eso que, sea cual sea la información que se obtiene de la página de urea se puede verificar con la otra técnica analítica.
    Por ejemplo, puede utilizar las técnicas de filtrado de gel que puede utilizar el experimento de enlace cruzado que puede hacer el experimento basado en CD, entonces usted puede hacer algunos experimentos basados en fluorescencia.
    Para verificar aún más que usted tiene los procesos de desarrollo de múltiples pasos que están sucediendo en esta proteína en particular porque usted tiene los 3 o 4 dominios diferentes que se están plegando de una manera diferente. Así que con esto me gustaría concluir nuestra conferencia aquí en la conferencia subsiguiente vamos a tomar algunos experimentos más emocionantes donde vamos a utilizar la electroforesis como una herramienta para responder a esas preguntas y para resolver esas preguntas y con esto me gustaría concluir nuestra conferencia aquí gracias.