Electroforesis en gel horizontal Hola a todo el mundo esto es Doctor. Vishal Trivedi del departamento de biociencias y bioingeniería IIT Guwahati. Y con en la electroforesis estuvimos discutiendo sobre el principio básico de electroforesis seguido de nosotros también hemos discutido acerca de la electroforesis en gel vertical y cómo realizar la electroforesis en gel vertical. Así que en la conferencia de hoy vamos aa discutir sobre la electroforesis en gel horizontal.(Consulte el tiempo de la diapositiva 01:31)
Así que en la electroforesis de gel horizontal la electroforesis en este sistema de gel se realiza en una pasión continua decon los dos electrodos y el cassette de gel están sumergidos dentro del búfer. Lo que significa la electroforesis continua es que la corriente no fluye a través del gel. Lo que significa que es realmente continuo por ejemplo cuando se está ejecutando la electroforesis en gel vertical o si se recuerda que tiene las 2 cámaras.
Una es la cámara superior donde se mantiene el buffer ok y que es el electrodo negativo. Y luego tienes la cámara inferior donde tienes la otra vez los buffers ok y luego tienes los electrodos de carga positiva ok. Y en entre estas 2 cámaras tienes el gel realmente que está emparedado dentro de las placas de vidrio. Así que aquí tienes el gel de poliacrilamida y porque y así la corriente no puede directamente pasar de un electrodo negativo a positivo.Mientras que la corriente tiene que pasar con este gel y luego el gel está realmente conectando las 2 cámaras de electrodos de. En comparación con eso en el gel horizontal tienes una cámara donde tieneslos electrodos negativos y luego tienes el electrodo positivo y luego una losa de gel estásumergida con en el búfer. Así que el búfer está en la parte superior del gel, el buffer está en la parte inferior deel gel y es por eso que la corriente puede moverse libremente a través de este sistema.Así que la corriente puede fluir a través de esta solución de almacenamiento intermedio y la solución de almacenamiento intermedio es tambiéncontinua. Mientras que en este caso, las cámaras de almacenamiento intermedio de almacenamiento intermedio 2 están conectadas a través del gel.(Consulte el tiempo de la diapositiva 03:32)
Por lo tanto, la cámara de electroforesis tiene 2 electrodos de platino colocados en ambos extremos y sonconectados a la fuente de alimentación externa de un paquete de energía que suministra una corriente directa o el voltaje DC de. Así que usted tiene una cámara de electroforesis donde usted tiene un electrodo negativo y el electrodo positivoen ambos lados. Y a continuación, estos electrodos están conectados al cod de alimentación parael paquete de alimentación.
Y este paquete de alimentación puede suministrar el voltaje de CC de cualquier cantidad. El tanque se llena con el buffer en funcionamiento dey el gel quemado se sumerge dentro del buffer. Hay necesidades adicionalesnecesarias para echar el gel de agarosa como peine. Peine es necesario para preparar los pozos diferentesy entonces se requiere el espaciador, entonces se requiere el gel caster. Por lo tanto, ¿cómo ejecutar el gel de agarosaelectroforesis?(Consulte el tiempo de la diapositiva 04:30)
Así que antes de discutir acerca de cómo ejecutar la electroforesis de gel de agarosa, deje entender el reactivo, así como el instrumento que usted necesita. Así que para el buffer el propósito de cada reactivoutilizado en la electroforesis en gel horizontal es el siguiente. Así que se requiere agarosa, por lo que agarosa es un azúcar poliméricoque se utiliza para preparar el gel horizontal para el análisis de ADN.Entonces usted requirió el bromuro de etidio, por lo que el bromuro de etidio es un tinte que en realidad va ausar para manchar el ADN. Así que ver el tan etidio bromuro es necesario para la tinción del gelagarosa para visualizar el ADN. A continuación, se requiere la sacarosa, se requiere sacarosa para la preparación deel colorante de carga para el gel horizontal. Si usted recuerda que estábamos usando el glicerol en el caso dela página de SDS.Así que usted tiene la opción de usar el glicerol o la sacarosa el propósito es que usted quiereproporcionar una solución de alta densidad. Para que el, lo que se cargue en el gel permanecerá dentro deel gel. A continuación, necesita el tris HCL, el tris HCL es el componente del almacenamiento intermedio en ejecución yentonces necesitará el azul bromofenol, el azul bromofenol es un tinte de rastreo para supervisar el
progreso de la electroforesis. Ahora, una vez que prepare el almacenamiento intermedio y los reactivos, puederealizar realmente la electroforesis de agarosa de gel horizontal. ((Consulte el tiempo de la diapositiva 06:04)
Para realizar la electroforesis de gel de agarosa la primera que tiene que echar el gel se compara con el gel de acrilamida dedonde realmente va a añadir el enlazador cruzado y luego va a añadirel temed y APS para inducir las reacciones de polimerización. Aquí usted realmente no va a hacerque para la fundición del gel. ¿Qué vas a hacer es? Solo vas a tomar la agarosa. Así queagarosa es el azúcar.Así que, cuando usted hierve esto y es el polímero en realidad cuando usted hierve este azúcar que en realidad va aformar una solución como la jalea. Al igual que usted podría haber visto cuando usted cocina el arroz en su casay si usted hierve el arroz en realidad le da alguna cantidad de almidón. Así que es agarosa también es similartipo de carbohidratos por lo que si usted hierve el gel en realidad forma una solución de gelatina como. Yentonces si vierte como la solución como jalea en una bandeja que en realidad contiene el peine cuando la gelatinacomo la solución fría entonces usted va a tener una losa de gel.Así que para la fundición del gel diferente paso para echar el gel de agarosa para gel horizontalelectroforesis se dan en la figura. El polvo de agarosa se disuelve en un tampón tampón de pruebaTAE o TBE. Y luego calentaste para derretir la agarosa. Se vierte agarosa caliente en el casete de gely se le permite establecer. Se puede insertar un peine en el agarado caliente para convertir bien el gel paracargando los ejemplos.
En pocos casos podemos añadir el bromuro de etidio dentro del gel para que tiñe el ADN mientras la electroforesis deestá pasando. Así que lo que usted va a hacer es que usted va a tomar la cantidad necesaria dede la agarosa en un vaso de agua y luego usted hierve esto usted puede utilizar el quemador o usted puede usarel microondas. Y luego una vez que se disuelve entonces en este paso usted puede realmente tener una flexibilidadde agregar el EtBr.Y luego lo vierte en el cassette de gel y antes de que se solidifica también puedes poner el peinepara que en realidad te va a dar los pozos. Y una vez que los pozos estén preparados, puede cargarlas muestras en esos pozos particulares y puede disolver el ADN de gel para visualizar.(Consulte el tiempo de la diapositiva 08:28)
Ahora el casete de gel se coloca en el tanque de electroforesis sub sumergido completamente y el ADN dese carga en el pozo con la ayuda de una pipeta y corre con un voltaje constante. Así queuna vez que el gel esté preparado, entonces usted puede simplemente sacar el gel del casete de gel ponerlo en elsu almacenamiento intermedio que se pone en la cámara de electroforesis y luego se conecta.Entonces usted carga su ADN y lo conecta a la energía de DC con la ayuda del banco de energía que ustedpuede suministrar el voltaje constante y entonces usted puede disolver el ADN en el agarosa. Y el ADN decorre de lo negativo al final positivo y el bromuro de etidio realmente corre presenteen el gel mancha el ADN. Observar el gel de agarosa en la cámara UV muestra que, el ADNmanchado con el EtBr como la fluorescencia de color naranja.
Entonces, lo que sucede en este caso es que cuando usted tiene un electrodo de carga negativa y luego unelectrodos de carga positiva y luego usted tiene un lugar donde realmente puede cargar el ADN. Así quelo que sucederá es el ADN porque el ADN es la carga negativa que realmente corre en esta direcciónporque corre hacia el tamaño positivo. Mientras que el EtBr es un tinte de carga positivaasí que EtBr es en realidad corre en esta dirección.Así que mientras están corriendo en direcciones opuestas el EtBr es mancha el ADN y EtBr es manchas el ADN dedentro del grupo mayor y menor lo que significa que el EtBr realmente se intercala dentro del ADN de. Así que usted sabe que el ADN tiene 2 hebras y si estas 2 hebras en realidad están teniendo la baseen los lados. Así que dentro de la base el EtBr se está intercalando y como resultado realmente da ala fluorescencia naranja cuando los visualiza bajo la UV.Y lo que se ve es cuando se mantiene el gel de agarosa en la cámara UV que se va aver el color naranja brillante ADN brillando dentro de la agarosa. Así que no hay un paso de manchasrequerido porque el EtBr sólo da la fluorescencia cuando interactúa con el cuando interactúacon el ADN y se intercala dentro de la base. Es por eso que no hay un paso de manchas esrequerido porque el EtBr que no está interactuando con el ADN no da la fluorescencianaranjaY lo que puedes ver es por ejemplo en esta imagen representativa en particular lo que yo soy lo que nosotrosestamos mostrando es que estos son el ADN del plásmido que se ha resuelto en el gel de agarosay te están mostrando la mancha intensa. Lo que se ve es esta señal borrosa del gel esen realidad el ARN. Así que el ARN nunca se está resolviendo y nunca le da la banda compactadebido a que el ARN le va a dar las apariencias de hissy.Así que con esto le hemos dado la información teórica completa de cómo realizar la electroforesis de gel dey cómo ejecutar la electroforesis en gel. Pero la información teórica no es suficientepor eso me gustaría llevarle al laboratorio donde hemos preparado un pequeño clip de demostracióndonde hemos mostrado cómo hervir las muestras cuál es la precaución que debe tomarcuando esté hirviendo la solución de agarosa y luego cómo verterla y luego cómo prepararel gel?
¿Cómo preparar los pozos? ¿Cómo cargar el ADN? ¿Cuál es la precaución que debe tomar mientrasestá cargando el ADN en la cámara en los pozos? Y en última instancia; ¿cómo visualizarestos gel en las cámaras UV? ¿Cuál es la precaución que debe tomar al visualizar el ADN deen las cámaras UV porque como usted sabe que el EtBr UV y todos estos son peligrosospara peligroso para el ser humano. EtBr es una de las moléculas cancerígenas.Así que en realidad causa el cáncer. Así que es por eso que tienes que usar siempre los guantes cuando estásrealizando la electroforesis de gel de agarosa. Así que en este demo los estudiantes le han mostrado cómo realizarel gel electro para la electroforesis en gel horizontal, la electroforesis de gel de agarosa.(Video Starts: 13:05)(Consulte el tiempo de la diapositiva 13:05)
Hoy le vamos a dar la demo de la electroforesis de gel de agarosa que usamos para disolver el ADN Así que en un típico de los separadores de electroforesis de gel de agarosa lo que necesita es quetiene horizontal que tiene la cámara de almacenamiento intermedio donde puede tener los 2 electrodos. Puede tenerel ánodo que es el electrodo de color negro y luego puede tener el cátodo.Este cátodo y ánodo irán y se alojarán en la cámara de almacenamiento intermedio. La conexión de estos cables a los cables de alimentación detiene los 2 cables diferentes uno es el cable rojo y uno es el de los cables negros. Yaparte de estos también necesitas un caster de gel donde puedas poder echar el gel. Así que esta es la bandeja de gel pequeño deque puede utilizar para causar los geles de agarosa. Y aparte de que también tiene el peineque en realidad se puede utilizar para preparar el pozo.
Y además de este reactivo lo que necesita para realizar la electroforesis de gel de agarosa necesita el polvo de agarosa deque puede comprar a la sigma o a cualquier otra compañía de muy alta calidad.Entonces usted requiere el EtBr que es el tinte de tinción y como puede ver que el EtBr está siendoguardado en un vial que está cubierto con la lámina porque EtBr es sensible a la luz. Y así debe serprotegido de la luz.Y aparte de eso también se requiere el buffer en funcionamiento que es el 50 STA y así comencemosel casting del gel de agarosa y realizando la electroforesis en gel. Antes de empezar la preparación dedel gel de agarosa lo que tienes que hacer es que tienes que poner la bandeja para que puedaspara verter la agarosa en ese gel en particular en particular bandeja y luego podrías echar.Lo que tienes que hacer es que tienes que tomar esta bandeja tienes que limpiar muy cuidadosamente las bandejas ycon el agua así como, para que quede libre de cualquier tipo de contaminaciones y cualquier tipo deporque sabes que el ADN es muy sensible para el ADN ’ s para el otro tipo de enzimas.Entonces lo que tienes que hacer es que tienes que mantener esta bandeja de esta manera en este caster de gel y con la ayuda de estos tornillos tiene que atornillar la bandeja de gel.Y tiene que apretarla y como puede ver que lo estoy apretando con los dos tornillossimultáneamente para que quede completamente sellado. Y luego ahora una vez que esta bandeja se selló yestás listo para echar la agarosa lo que tienes que hacer es que primero tienes que poner el peine. Ycuando pones el peine lo que tienes que hacer es que tienes que asegurarse de que hay una brecha suficienteentre el peine, así como el extremo inferior del peine, así como la bandeja que el espacio del agarosava a llenar y es como en realidad va a ayudar a preparar el pozo.Así que para el gel típico de gel agarosa electroforesis lo que tienes que hacer es que primero tienes que prepararel buffer 1X TAE para un tipo típico de cámara pequeña. Usted requirió en algún lugar alrededor de 300 a400 ml de almacenamiento intermedio y para el gel también requiere al menos 30 a 40 ml. Pero así que para un lado más seguro lo quepodemos hacer es simplemente preparar el gel de agarosa de 50 ml y para un ADN de alrededor de 1 KB a alrededor de 1KB en realidad se puede ejecutar gel de 0,8% porque a medida que el tamaño del ADN bajará, tienes que manteneraumentando el tamaño del porcentaje de agarosa.
Así, por ejemplo, si se le indica que explore el que conoce composes o la segmentación directa enesos casos la banda de gel o la banda de ADN lo que está esperando es de 200 peso base amayor peso molecular. Así que en esos casos normalmente corremos el agarosa del 2%. Pero en el másde los casos lo que hacemos es que corremos alrededor del 0,8% de gel de agarosa y eso es lo suficientemente bueno para resolverla mayoría de los tamaños de ADN.Así que para preparar un agarosa de 50 ml 0,8% lo que necesitas es que solo tienes que usar los 0,4 gramos deel agarado y luego tienes que hervirlo en el microondas y luego puedes prepararte. Así que vamosa entender cómo hacerlo. Ahora lo que hemos hecho tenemos peso la cantidad requerida deagarosa y luego hemos preparado el buffer 1X TI y parte del buffer que hemos vertido enla propia cámara y la para preparar el gel de agarosa lo que hemos hecho es que hemos tomadocasi 70 ml del buffer porque cuando hiervas habrá siempre una pérdida de algunos búferes.Entonces, ¿qué hemos calculado? Hemos calculado de 50 ml y ahora estamos manteniendo de 10 a 15 mlde más agua porque cuando hiervas esto vas a amortiguarlo el agua lo va a amortiguary por eso vas a perder algo de agua. Así que una vez que usted va a echar elagarosa en el buffer y entonces usted va a hacer la ebullición. Así que lo que puedes hacer es queun microondas y simplemente encender el microondas y lo que tienes que asegurar en el microondasen realidad está hirviendo el agarado y derritiéndola.Así que en este proceso lo que sucederá es que el agua se va a calentar y la agarosa se va a derretir Y una vez que el agarosa se va a derretir, en realidad va a hincharse y va atomar el agua. Y en ese proceso en realidad va a hacer un material viscoso o la gelatina viscosa decomo material y eso es lo que está en el gel de agarosa. Así que, pero antes porque el que esir a hervir es en realidad también puede salir del panadero. Así que hay que mantener la apertura dey mantener la comprobación que es algo que no está sucediendo.Y en medio hay que mezclar siempre porque la agarosa es la compuesta de azúcar. Así que tambiénpuede ser carbonizado si consigue calefacción localizada. Y una vez que su agarosa se va a calentar entoncespuede ser capaz de usar eso y usted tiene que asegurarse de que lo hervir muy cudly. De modo que todo elgranulado lo que está presente en el usted sabe que el agarosa debe ser fundido. Vamos a comprobar siesas agaradas se derritieron o no.
Para comprobar lo que hacemos es que tenemos diferentes tipos de guantes que los guantes como se hacede goma y estos son los guantes lo que se puede utilizar para tocar las soluciones calientes porque elnuestros guantes normales lo que estoy usando ahora mismo no es lo suficientemente bueno. Así que tenemos que calentar poco másporque todavía puedo ver algunos de los gránulos de agarosa. Así que una vez que este paso haya terminado, entonces usted tienepara simplemente sacar el agarosa lo que tiene que ver que es el agua está hirviendo ahora bien y el vapor deestá saliendo.Así que esto es realmente áspero estimado que usted va a perder en algún lugar alrededor de 10 a 15 ml de aguaen el proceso de ebullición. Ahora lo que tienes que hacer es simplemente dejar que se enfríe paraen algún momento y luego hay que añadir el tinte. Así que en este caso estamos añadiendo el EtBr así que una vez que se enfríase puede simplemente añadir el 3 microlitro de EtBr y recordar que EtBr es un tinte de agente fundido.Así que tienes que muy cuidadoso siempre tienes que usar los guantes y tienes que descartar estos tipmuy a fondo o muy porque no quieres contaminar el medio ambiente. Así que este consejo comobien como todo el fósforo tiene que ser descartado de una manera para que no sea para salir. Así que añade elEtBr y luego mantiene este consejo en un espacio seguro para que sea capaz de lanzar esto en una bolsa de basuraque está destinada a recoger el material de carpintero.Ahora su solución está lista y puedo verter esto en la bandeja. Así que sólo puede verter esto enla bandeja y tenemos que ponderar por algún tiempo para que se solidifice y luego se puede cargarel ADN y podemos correr el agarosa. Ahora se puede ver que el gel de agarosa se está solidificandoy se puede ver que está claro. Así que no hay gránulos o el granulado o el material precipitadopresente. Y ahora lo que tenemos que hacer es que tenemos que eliminar este formulario y tenemos que mantenernos enla cámara y entonces vamos a estar listos para usar.Así que antes de hacer eso hay que añadir una cantidad de buffer en esta bandeja. Así que lo que tienes que haceres que tienes que añadir alguna cantidad de buffer ok. Y entonces usted tiene que muy cuidadosamente sinhacer ningún movimiento en la dirección de largo plazo usted tiene que elevar verticalmente el peine enla cámara superior como este ok. Y eso en realidad va a preparar el pozo. Así que lo que pueden verahora son los pozos en este bloque de agarosa en particular ok.
Y una vez que seguro que no hay fugas y hay todos estos pozos son lo suficientemente buenos y entonceslo que puedes hacer es? Puede desenroscar esta bandeja o el casete y vamos a eliminar el peine de. Entonces, ¿qué vamos a hacer? Vamos a eliminar esto en esta cámara y entoncesvamos a quitar el peine muy cuidadosamente se quita el peine ok. Y entonces usted va allenar la cámara con el buffer.Así que cuando lo llene con un buffer completo el gel va a estar sumergido y es por eso que este tipo particularelectroforesis en gel se llama como la electroforesis de gel continua. Ahora lo quese puede ver es que podemos ver los pozos en el gel. Así que si ves el gel puedes ver el pozoen realidad y ahora vamos a cargar la muestra en esos bien y luego vamos aconectar la cámara a la fuente de alimentación de electroforesis.Y luego va a realizar la electroforesis. Para preparar la muestra de ADN lo que tenemoshecho es que tenemos que añadir realmente 10X carga de tinte. Así que, por consiguiente, usted acaba de tomar el ADNusted agrega esta pequeña cantidad del buffer y luego usted agrega el buffer de carga de tal manera queva a ser 1X y entonces usted va a cargar la muestra. Así que en este caso estamos cargando el micro-litro 25de la muestra.Así que usted va a tomar la muestra en la pipeta ok asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire. Yentonces usted va a visualizar el gel y lo que puede ver en realidad o en algún momento si hay un problema deen mirar un pozo o hay un problema de visibilidad de los pozos porque en algún momentola cámara baja o el fondo inferior también va a ser transparente. En ese caso, usted puedesimplemente poner un papel negro en ese lugar donde usted tiene los pozos.Y eso en realidad le va a permitir ver el pozo correctamente. Así que deje ver cómo cargar esto para quemantenga su pipeta bien y luego traiga su punta al lado del pozo y luego cargue la muestra de. Y lo que verán es que el ADN se está construyendo en el pozo. Así que ahora vea aquícómo estoy cargando la muestra ok. Así que he tomado el microlitro de 20 y primero voy a hacer es que voy a tomarmi punta en el pozo y luego voy a cargar lo que usted verá es cuando estoy cargando voy a muymuy lentamente estoy manteniendo mi punta fuera bien.Así que todo el pozo va a llenar con esa punta, pero lo que hay que recordar es que mientrassu punta es o mientras que su punta está dentro del pozo no debe dejar su émbolo. De modo que debe
no crear ninguna burbuja de aire porque eso suceda el ADN saldrá bien. Por ahora lo que haremoses que conectaremos esto al cordón para que el negro vaya con el negro y el rojo irá conel rojo. Así que antes de hacerlo tenemos que poner la tapa para que no haya evaporación del buffer de.Así que sólo tienes que conectar el negro a negro y rojo a rojo y ahora tenemos que encender el banco de energía.Así que en un banco de energía tienes un interruptor aquí que en realidad permite el encendido. Conectamos la cámarao la cámara de electroforesis con una unidad de fuente de alimentación que la vamos a establecer a 80 voltios y ahoraestá funcionando. Y lo que verá es una vez que el tinte de ADN (()) (26:39) llegue hasta el final del gel de. Entonces en realidad vamos a retirar el gel del aparato.Y luego, ya que solo hemos añadido el EtBr en el gel. El EtBr va a correr del lado negativo dea lado positivo. Mientras que el ADN va a correr desde el hacia el lado positivo deporque el ADN se carga negativamente y el EtBr es el cargado positivamente. Así queen un lado opuesto mientras están corriendo el EtBr va a intercalar dentro de la base deel ADN. Y así es como en realidad se va a quedar en el gel en el ADN en el presente en el gel.Así que después de eso lo que tienes que hacer es que tienes que sacar esta bandeja y meterla en la máquina de gel docy que en realidad va a visualizar. A continuación, cierre la aplicación de la aplicación del ácido nucleico, la exposición al bromuro de etidio, la exposición óptima o podemos seleccionar el manual también entonces vamos a adquirirlas imágenes. Ahora usted puede encontrar aquí esta es la escalera del ADN este es el producto amplificado por PCR.(Video Ends: 28:29)Así que en la demo que he explicado todos los aspectos relacionados con la electroforesis del gel de agarosa¿cómo realizar la electroforesis en gel? Y con esto me gustaría concluir nuestra conferencia aquíy en una conferencia posterior también vamos a discutir diferentes variantes de la electroforesis de electroforesisy cómo usted puede ser capaz de utilizarlos para explorar la respuesta o para la solución delas preguntas experimentales gracias.