Reactivos en Electroforesis Gel Hola a todos, se trata del Dr. Vishal Trivedi del departamento de biociencias y bioingeniería IIT Guwahati. Y empecemos nuestro nuevo tema y el nuevo tema es la electroforesis. Por lo tanto, la electroforesis es una técnica que se utiliza para analizar las biomoléculas como la proteína o el ADN. Y para separarlos en función de la carga o del peso molecular o de todas las demás propiedades bioquímicas. Por lo tanto, empecemos a discutir acerca de la electroforesis. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 01:33) Por lo tanto, como su nombre indica, la electroforesis significa el estudio o la separación de la molécula cuando se están ejecutando en el campo eléctrico. Por lo tanto, usted puede imaginar que usted tiene una biomolécula que es o usted tiene una molécula cargada que contiene la carga Q y se está ejecutando en un campo eléctrico. Por lo tanto, la electroforesis es un proceso electro cinético que separa la partícula de carga en un fluido que utiliza el campo de la carga eléctrica. Se utiliza con mayor frecuencia en las ciencias de la vida para separar las moléculas de proteínas o la molécula de ADN y se puede lograr a través de varios procesos diferentes, procedimientos dependiendo del tipo y tamaño de las moléculas. Por lo tanto, antes de entrar en el detalle de la electroforesis y cómo realizar la electroforesis, primero discutamos cuál es el principio básico de la electroforesis. Así, que usted será capaz de entender todos y cada uno de los factores que está influyendo en el movimiento electroforético de o el movimiento de la molécula dentro del campo eléctrico. Por lo tanto, que usted será capaz de utilizar esos factores para traer la mejor separación. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 02:49) Por lo tanto, puede imaginar que una partícula cargada Q se está moviendo en un campo eléctrico E y cuando una partícula cargada se está moviendo en campo eléctrico, en realidad va a experimentar una fuerza electroforética que va a estar en la dirección del campo eléctrico. Y la cantidad va a ser la F es igual a Q E que es donde la E es la fuerza del campo eléctrico y q es la carga de esta partícula en particular. Pero cuando una molécula se está moviendo en un campo eléctrico, y si el material a través del cual esta molécula se está moviendo realmente va a experimentar las fuerzas de fricción. Las fuerzas de fricción van a oponerse al movimiento de esta molécula en el campo eléctrico. Y las fuerzas de fricción van a ser equivalentes a la f v donde la f es la constante de fricción. Por lo tanto, f es el coeficiente de fricción y la v es la velocidad de la movilidad electroforética. Este movimiento de un objeto esférico a través de un medio líquido de la viscosidad n, la fricción del coeficiente f se da por la fórmula 6 pi eta rv. Lo que significa si una molécula se está moviendo a través de un medio líquido que es suponer el gel. Entonces la viscosidad y la fricción van a tener lugar. Y como resultado las fuerzas de fricción van a ser equivalentes a los 6 pi eta r y v. Y ahora, imaginemos que esta molécula dejará de hacer cualquier tipo de movimiento. Por lo tanto, el lugar donde el movimiento de una molécula esférica de la viscosidad y el coeficiente de fricción f es dado por el 6 pi eta rv. Y el lugar donde partícula tendrá tanto las fuerzas equivalentes o ambas de estas fuerzas son equivalentes. Ese es el lugar donde la molécula va a detener el movimiento. Y ese lugar el QE que significa las fuerzas electroforéticas, así como las fuerzas de fricción van a ser equivalentes. Por lo tanto, en este lugar la movilidad electroforética será dada por la fórmula v es equivalente a Q por 6 pi eta r. Mientras que, la Q es equivalente a la ze que significa que si la molécula se compone de las biomoléculas, usted puede calcular la carga simplemente por tener la valencia donde la z es la valencia y la E es la carga electrónica. Así que, si multiplicas las dos cosas vas a conseguir la carga, por lo que la movilidad electroforética se puede expresar como la ze por el 6 pi eta rv. Entonces, lo que ves es el ze por el 6 pi eta r. Y lo que ves aquí es que este componente es en realidad una constante que significa, no va a depender de la molécula lo que significa que el v es directamente proporcional a la z por la r. (Ver Diapositiva: 06:28) Por lo tanto, la movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga que es ésta, y la inversamente proporcional a la viscosidad de los medios, tamaño y forma de la molécula. En el caso de la movilidad relativa, está directamente relacionado con la carga por un radio de la molécula. Eso es lo que se dice derecho v es equivalente a z por e que significa v es directamente proporcional a la z y v es inversamente proporcional al 1 por r. Por lo tanto, esto es r en realidad, lo que significa y r es directamente proporcional a la masa de la molécula. Por lo tanto, para una proteína globular, el radio de la molécula está directamente relacionado con la masa molecular de la molécula macro, lo que significa que la movilidad relativa v es directamente proporcional a la carga e inversamente proporcional a la masa. Por lo tanto, esta es la relación entre la movilidad electroforética y la carga de la masa se puede explotar para separar los diferentes tipos de molécula. Porque las diferentes moléculas van a tener los diferentes cargos y también van a tener las diferentes masas. Y esta es la forma en que la gente ha pensado que si resolvemos las moléculas en el campo eléctrico podemos ser capaces de separar la molécula que utiliza esta propiedad en particular. Así pues, para resolver las moléculas han diseñado diferentes tipos de los operadores electroforéticos. Porque lo que supones entender es que te interesa hacer la electroforesis pero no te interesa hacer la electrólisis. La electrólisis es un proceso donde la molécula se ejecutará a través del campo eléctrico y luego llegarán a sus respectivos electrodos y allí la molécula se va a desglosar en los átomos individuales y es así como se va a romper la molécula con la ayuda del campo eléctrico. Por lo tanto, eso se llama como la electrólisis, mientras que en el caso de la electroforesis la molécula siempre se mantiene intacta. Y corre a través del campo eléctrico, de manera que se va a separar de la otra molécula basada en el cargo por masa. (Véase el tiempo de la diapositiva: 08:53) Así, el primer aparato que la gente ha diseñado es llamado como la electroforesis límite en movimiento. Por lo tanto, en este método la electroforesis se lleva a cabo en solución sin un soporte de soporte. La muestra se disuelve en tampón y la molécula se mueve a su respectivo electrodo de contador cargado. La muestra se carga en el medio del tubo U y luego el aparato se conecta a la fuente de alimentación externa. La molécula de carga se mueve al electrodo opuesto a medida que pasa a través del refractómetro, se puede medir un cambio. Como la molécula deseable pasa la muestra se puede sacar del aparato junto con el búfer. Por lo tanto, en una electroforesis límite en movimiento lo que han hecho es que han hecho un tubo de color U ok. Y en este tubo de color U han puesto el cátodo en un lado y el ánodo en el otro lado y esto se conecta a través de una cámara de carga de muestra. Por lo tanto, desde esta cámara en realidad se puede cargar las muestras entonces la muestra se va a llenar en este tubo medio. Y luego van a conectar el cátodo y el ánodo a la fuente de alimentación externa. Entonces, lo que sucederá es que las moléculas cargadas positivamente van a correr hacia el cátodo mientras que las moléculas cargadas negativamente se van a mover hacia el ánodo. Y en el extremo terminal de estos entubados han puesto los refractómetros en ambos lados. Por lo tanto, lo que sucederá es el refractómetro es un aparato que realmente mide el cambio en el índice de refracción de una solución particular. Por lo tanto, lo que sucederá es tan pronto como la molécula pase a través de estos refractómetros habrá cambio en el índice de refracción de este búfer particular. Y como resultado sabrán que cuando una molécula particular está saliendo pero eso es muy, muy ambiguo, eso no es muy preciso. Y por otro lado hay múltiples problemas cuando estaban pasando por la electroforesis límite en movimiento, cuáles son estos problemas. La resolución de la técnica es muy baja debido a la mezcla de la muestra, así como a la superposición del componente de la muestra. Por ejemplo, si carga la muestra en el medio porque todo esto es lo que está haciendo en un almacenamiento intermedio que en realidad no tiene ningún soporte de soporte. Así que, tan pronto como se enciende el campo eléctrico, los iones se están moviendo hacia los electrodos del contador, pero tan pronto como se apaga el poder todos comienzan a mezclar bien. Y porque está sucediendo en los medios de comunicación libres, habrá una mezcla de las muestras, no habrá separaciones y no habrá manera de que sabrás qué molécula se está moviendo o pasando a través de un refractómetro. Así que, por eso siempre tiene un problema de la ambigüedad porque hay que estandarizar muy bien. Por lo tanto, que usted sabrá cuando su molécula de interés está pasando por el refractómetro. Por lo tanto, que en realidad se puede poner la pipeta y podría ser capaz de sacar una muestra del aparato de electroforesis límite en movimiento. Por otro lado, la técnica de electroforesis no es buena para separar y analizar la compleja muestra biológica. En cambio puede ser utilizado para estudiar el comportamiento de la molécula en un campo eléctrico, lo que significa que este aparato fue lo suficientemente bueno para estudiar el comportamiento de la molécula, lo que significa, dirá si la molécula se moverá hacia el cátodo o molécula se moverá hacia el ánodo. Pero nunca fue lo suficientemente bueno para separar la compleja mezcla biológica, por ejemplo si usted carga el lisato de E. Coli o las células de mamífero se lijar, no será capaz de resolver las muestras. Porque para resolver usted no tiene nada que apoyar a los medios de comunicación, de modo que en realidad va a experimentar cualquier tipo de fricciones o cualquier clase de usted conoce la separación de las moléculas. Por lo tanto, debido a que la electroforesis límite en movimiento no era muy popular y entonces la gente ha comenzado a desarrollar las nuevas técnicas. (Consultar Tiempo de Slide: 13:15) Entonces han desarrollado la electroforesis de la zona. Por lo tanto, en este metodo se utiliza un medio de soporte polimerico inerte entre el electrodo para separar y analizar la muestra. Los medios de soporte utilizados en la electroforesis de zona son papel absorbente, gel de almidón, agar y poliacrilamida. La principal ventaja de la presencia de soportes de soporte es que minimiza la mezcla de la muestra e inmovilización de la molécula después de la electroforesis. Hace que el análisis y la purificación de la molécula del gel sea más fácil que la electroforesis límite en movimiento. Por lo tanto, el cambio mayor lo que la gente ha hecho cuando se estaba moviendo hacia la electroforesis de la zona es, que han empezado a poner el algún tipo de soportes de soporte, lo que significa que han puesto algunas sustancias poliméricas o algún tipo de gel. Por lo tanto, que la molécula será inmovilizada en ésos. Por lo tanto, debido a eso la molécula se va a separar y usted puede ser capaz de visualizarlos porque están inmovilizados en la sustancia de soporte. Y luego puedes manchar y destinar esas sustancias de apoyo para saber cuál será el patrón. Y entonces por consiguiente usted puede optimizar las técnicas de supresión y por consiguiente usted puede ser capaz de lograr las mejores purificaciones. Las sustancias que utilizaban para los soportes de soporte son el papel, el almidón, el agar y la poliacrilamida. Por consiguiente, la electroforesis en gel límite en movimiento también se llama electroforesis en gel. Y dentro de la electroforesis en gel se tiene el modo 2 en el que se puede poder realizar la electroforesis en gel cuando se llama como la electroforesis en gel horizontal, lo que significa que se está realizando la electroforesis en gel en la dirección horizontal. Por lo tanto, la electroforesis en gel en este sistema se realizó de manera continua, el ejemplo clásico de esto es la electroforesis de gel de agarosa, luego se tiene la electroforesis en gel vertical. Por lo tanto, en una electroforesis en gel vertical se está realizando la electroforesis de arriba a abajo. La electroforesis en este sistema se realiza de manera discontinua con el amortiguador en el tanque superior e inferior conectado por la losa de gel. Tiene la modificación múltiple en la condición de ejecución para responder a las múltiples preguntas analíticas. Por lo tanto, esta electroforesis de zona también se llama electroforesis en gel y la electroforesis en gel se puede realizar en 2 modos diferentes. O bien la electroforesis en gel horizontal donde el sistema va a ser continuo y el segundo es la electroforesis en gel vertical donde se va a tener el sistema discontinuo, donde se coloca el gel entre los tanques superior y el inferior. (Ver Diapositiva: 16:12) Así, estos son los componentes de la electroforesis en gel vertical donde se tienen los casetes de gel, cámaras de electrodos. Luego tienes el tanque donde vas a colocar esto, entonces tienes que tener el peine, entonces tienes estos electrodos o el cable de alimentación. Y entonces usted tiene la unidad de suministro de energía que en realidad va a suministrar la energía deseable entre los electrodos. Por lo tanto, estos son los electrodos que está siendo presente en la cámara del electrodo. (Ver Diapositiva: 16:46) Los reactivos que usted está buscando para la electroforesis en gel vertical. Por lo tanto, el amortiguador y el reactivo para la electroforesis, los diferentes amortiguadores y reactivos con su propósito para electroforesis vertical es el siguiente. Lo primero que necesita es el TEMED o la N, N, N, N-tetrametiletilendiamina. Y el TEMED es un catalizador, cataliza las polimerizaciones de acrilamida. Entonces usted requiere el amonio por sulfato o APS, es el iniciador de la polimerización de acrilamida juntos estos dos componentes son necesarios para polimerizar la acrilamida. A continuación, necesita la Tris HCL, por lo que Tris HCL es necesario para preparar la ejecución, así como los almacenamientos intermedios de conversión de gel. Entonces usted tiene la glicina que es un componente del buffer en funcionamiento, entonces usted tiene el bromofenol azul. Por lo tanto, el azul bromofenol es un tinte de rastreo y se requiere para monitorear el progreso de la electroforesis en gel. Entonces usted requiere el coomassie brillante azul R250 que es un tinte de tinción que en realidad va a manchar el gel de poliacrilamida. Luego se requiere el sulfato de dodecilo de sodio, el sulfato de dodecilo de sodio o el SDS. Se utiliza para desnaturalizar y proporcionar la carga negativa a las proteínas. Y luego se requiere la acrilamida, por lo que la acrilamida es la unidad monomerica que se usa para preparar el gel. Y luego se requiere la bis-acrilamida que es el enlazador cruzado para la polimerización del monómero de acrilamida para formar el gel. (Consultar Tiempo de Slide: 18:24) Ahora vamos a ver cómo la acrilamida va a ser polimerizada, así que lo que usted hace en realidad es que en realidad siempre está haciendo una solución de gel que es en realidad la solución de acrilamida al 30%. Así que, en la solución de acrilamida al 30% lo que haces es, añades los 29 gramos de acrilamida y luego 1 gramos de la Bis-acrilamida. Y manteniéndolo juntos cuando usted está añadiendo el TEMED y APS que en realidad está catalizando la unión del monómero de acrilamida con la bis-acrilamida. Por lo tanto, cómo se va a polimerizar la acrilamida, que se tiene la acrilamida y luego se tiene la Bis-acrilamida. Y cuando usted está incubando éstos con el TEMED y la APS, lo que sucedió es que la APS que es amonio por sulfato en la presencia de TEMED forma los radicales libres de oxígeno e induce la polimerización del monómero de acrilamida para formar un polímero lineal. Estos polimeros lineales estan interconectados por la reticulacion con el monomero de bis-acrilamida para formar una malla tridimensional con el poro. Por lo tanto, lo que sucedió es que estos monómeros de acrilamida están siendo polimerizados, por lo que formarán las fibras así. Así que, debido a que estas 2 moléculas están formando los radicales y suponen que forman los radicales en una molécula. Estos radicales radicales en realidad están interactuando entre sí y así es como están realmente haciendo las fibras poliméricas. Y entonces estas fibras polimericas tambien estan conectadas con la ayuda de la bis-acrilamida porque la bis-acrilamida tiene los grupos de reticulacion en ambos lados. Y así es como usted está realmente haciendo una malla 3-D que en realidad está conteniendo los poros en el medio. Y estos poros siempre se utilizan para la biomolécula al paso a través. Por lo tanto, debido a esta malla usted puede ser capaz de experimentar o usted puede ser capaz de producir la fricción para los diferentes tipos de molécula. Y así es como la fricción va a jugar en la separación de la molécula. Así que, debido a que esta malla tiene los tamaños de diferentes tamaños estas mallas van a jugar una especie de filtro de separación o algo así. Por lo tanto, que en realidad va a ayudar a conseguir la separación de las biomoléculas. El tamaño del poro está controlado por la concentración de la acrilamida y la cantidad de bis-acrilamida que significa. Si aumenta la concentración de bis-acrilamida o si aumenta la concentración de acrilamida, en realidad va a disminuir los poros. Porque se va a seguir poniendo más y más fibra y como resultado el tamaño del poro va a ser más pequeño y más pequeño, lo que significa que no se puede poder usar un gel muy, muy reticulado con una gran proteína. Porque si utilizas la gran proteína, la gran proteína no podrá entrar en estos poros y como resultado se va a quedar excluida del gel. En un sistema de electroforesis en gel vertical echamos 2 tipos diferentes de gel de apilamiento de gel y el gel de resolución. Primero la solucion de gel resolucion se prepara y se vierte en el cassette de gel, para la polimerizacion de una capa delgada de solventes organicos, tal como butanol o el isopropanol es estratificado en la parte superior para detener la entrada de oxigeno, por lo que es asi. Debido a que el oxígeno neutraliza los radicales libres y ralentiza la polimerización y mezcla la capa superior lisa. Después de la polimerización del gel de resolución, se vierte un gel de apilamiento y el peine se coloca en gel para la construcción de los diferentes carriles para la muestra. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 22:33) Por lo tanto, la ejecución de una electroforesis en gel vertical, ya que creo que discuta la necesidad de un casete de gel, entonces usted necesita una cámara de electrodos, entonces usted necesita un tanque. Y lo que usted hace en realidad es que primero vierte el gel de resolución porque estos son el gel que va a utilizar para la separación de la molécula. Y entonces encima de eso usted realmente va a poner el gel de apilamiento la diferencia entre la resolución y el gel de apilamiento es en términos de descomposición de la acrilamida. Así como el pH del búfer lo que utilizas para estos dos geles también son diferentes. Y luego cuando usted echa el gel de resolución, usted realmente puso la capa del solvente orgánico. Por lo tanto, que en realidad ayuda en términos de la polimerización de la acrilamida. (Tiempo de la diapositiva: 23:23) El funcionamiento del gel, la muestra se prepara en el tinte de carga que contiene el SDS que significa los agentes desnaturalizantes beta mercaptoetanol que realmente va a romper los enlaces de disulfuro. Y usted necesita y todos estos estarán presentando el glicerol porque el glicerol es necesario para proporcionar la densidad en la muestra. Por lo tanto, que facilite la carga de la muestra en el pozo. Ahora, desde estos pozos, por lo que se puede imaginar que se trata de un bien típico con donde se han cargado los diferentes tipos de muestras. Puesto que todas las muestras se llenan una vez verticalmente hay una deriva a distancia entre la molécula en una parte superior frente a la molécula en la parte inferior en un carril. Por lo tanto, puedes imaginar que tienes esto es un carril, donde tienes diferentes tipos de moléculas y todas estas moléculas están teniendo. Por ejemplo una molécula número 3 y la molécula número R, todas estas moléculas, imagínate si las 3 y R de un mismo peso molecular incluso entonces serán una deriva de las distancias entre el 2. Porque, así que si las resolves sin pasar por el apilamiento de la muestra o sin ponerlas en el mismo lugar para correr van a estar teniendo una deriva, puedes entender que simplemente mirando la pista de carreras. Por lo tanto, si ves una pista de carreras lo que ves es que los jugadores están sentados en una ubicación muy diferente. Debido a que todas estas diferentes ubicaciones el diámetro del círculo es diferente. Pero en este caso, usted no tiene tales opciones, por lo que lo que tiene que hacer es por cualquier medio que tiene que traer el 3 y la R juntos. Y usted puede hacer simplemente si usted hace un apilamiento de las muestras. Ahora la pregunta es cómo usted puede ser capaz de apilar la muestra. Por lo tanto, para apilar la muestra, primero hay que poner un gel de apilamiento. Por lo tanto, por eso el pozo tiene que estar preparado en el gel de apilamiento y hay que apilar la muestra. (Consultar el tiempo de la diapositiva: 25:34) Y por qué el gel de apilamiento está haciendo el apilamiento porque el pH del gel de apilamiento es de 6,8 y a este pH la glicina se mueve lentamente en la parte delantera mientras que el Tris HCL se mueve muy rápido. Por lo tanto, usted puede imaginar que tiene esto bien, donde este es el número de muestra 3 y este es el número de muestra R que está muy, muy lejos. Pero estas muestras están presentes en un amortiguador que en realidad está teniendo una composición de Tris HCL y glicina. Por lo tanto, y el pH de este gel es 6.8 que es en realidad el pH del gel de apilamiento. Así, a 6,8 la glicina está teniendo la muy, muy baja movilidad electroforética. Por eso habrá un bloqueo de la glicina en la parte delantera. Por lo tanto, usted tiene una glicina qué molécula que están sentados en el frente y luego tiene la molécula Tris que están realmente presentes en la parte superior. Por lo tanto, debido a eso usted puede imaginar que usted está poniendo las moléculas de las 2 moléculas como la molécula número 3 y la molécula R entre el tipo de donde se va a utilizar el tris como un émbolo. Por lo tanto, lo que sucede es que la Tris está empujando las moléculas, mientras que la glicina no está permitiendo que estas moléculas se muevan según su movilidad electroforética. Por lo tanto, debido a eso toda la molécula llegará a este punto y podrán ser apilados. Pero, lo que pasa es y esto sucederá porque se mantendrán corriendo en el gel de apilamiento durante algún tiempo. Y durante este período sólo los 3 y R se van a reunir y formarán una sola banda que en realidad va a contener 3 y R juntos y que sucederá mientras que se están ejecutando en el gel de apilamiento. Pero en cuanto entrarán en el gel resoluto, por lo que después de esto entrarán en el gel resoluto. Por lo tanto, resolver gel tiene un pH de 8.8 que significa a este pH la glicina ahora se carga y se mueve rápido y ahora la muestra se ejecuta según su peso molecular porque la SDS va a proporcionarles la carga negativa igual. Después de que el tinte de rastreo llegue hasta el fondo del gel, se saca gel de la placa de vidrio con ayuda de una espátula y se mancha con coomassie brillante azul R250, la proteína de manchas de tinte presente en el gel. Por lo tanto, tan pronto como entre en el tinte de apilamiento, este bloqueo de la glicina se va a eliminar. Y como resultado las proteínas o las moléculas se van a resolver con base en el peso molecular, el peso molecular más alto se va a ejecutar más lento y el peso molecular más pequeño se va a ejecutar más pequeño. Y porque quieres saber cuánto van a ir las moléculas o viajar al gel de resolución, también estás usando el tinte de rastreo que es el azul bromofenol. Y para que el azul bromofenol sea un tinte muy, muy pequeño, por lo que corre en la parte delantera y en cuanto llegue hasta el final del gel, podrás saber que ok la electroforesis ya ha terminado. Y luego puedo parar el gel y puedo sacar el gel y puedo hacer la tinción y el desabastecimiento y ver cuál es el patrón del gel. Así, todo esto se trata de la información teórica de la electroforesis, cómo la historia de los operadores electroforéticos, cómo se ha evolucionado a los operadores explotando el o desarrollando los diferentes tipos de operadores electroforéticos. Entonces, pero esto es todo el conocimiento teórico. Ahora, me gustaría llevarte a mi laboratorio y me gustaría mostrarte una pequeña demo, cómo echar los geles y cómo realizar la electroforesis. Y en esta demo los alumnos han disuelto las muestras y luego también te han mostrado cómo manchar y destain. (Video Starts: 29:55) En este video, le demostraremos cómo ejecutar un gel SDS-PAGE para preparar varios reactivos necesarios para el funcionamiento de SDS gel y cuáles son los diferentes instrumentos que podemos utilizar. Por lo tanto, aquí esta es la estampilla de fundición en gel, por lo que donde podemos usar estas placas de vidrio para preparar el gel. En medio hay un espacio donde podemos verter nuestro gel, solución de gel. Luego mantendremos por algún tiempo al menos de 20 a 30 minutos, que se solidarice, luego vamos a preparar el apilamiento de gel, entonces notaremos la solución de nuestra proteína. Así que, aquí antes de hacer eso necesitamos algunos reactivos, así que cuáles son esos reactivos, el primer reactivo que necesitamos para este experimento es la acrilamida. Por lo tanto, generalmente prepararemos acrilamida 30%, 30% significa 29 gramos de acrilamida y 1 gramo de bis-acrilamida. Estos dos podemos usar la proporción 29: 1 en 100 ml de agua para obtener el 30% de la acrilamida. Por lo tanto, ambas son neurotóxicas, por lo que tenemos que usar guantes siempre, después de esto tenemos que preparar la resolución de gel. Para la resolución de gel, necesitamos 1.5 molar Tris HCL, pH 8.8. Además de eso también necesitamos 10% SDS preparados en agua destilada doble y también 10% amonio por sulfato y también TEMED. El papel de amonio por sulfato y TEMED que podemos ver durante la preparación del gel, actúa como un catalizador. Después de solidificar tenemos que usar, nosotros cómo preparar el gel de apilamiento, por lo que el apilamiento de gel no es más que la composición es la misma. Pero podemos decir que es una diluida, contiene pH 6.8. Tris HCL y resto de componentes iguales pero en menos cantidades. Así, después de preparar el gel, cargamos el marcador y la proteína que se desnaturaliza a 100 grados centígrados durante 3 minutos. Después de eso vamos a arreglar este gel en este, seguimos recibiendo este depósito entonces nos conectaremos al paquete de energía y vamos a ejecutar el gel. Por lo tanto, esta es la introducción general de cómo preparar un gel SDS-PAGE. Así que empecemos a preparar gel, aprenderemos más cosas como preparar el gel. Antes de preparar el gel de resolución, tenemos que preparar la configuración del gel de fundición. Así, se trata de las placas de vidrio, esta es una muy delgada, por lo que esta es la placa de vidrio principal, se trata de placa de vidrio de 1,5mm, está disponible en placas de vidrio de 1mm también. Si su solución de carga es menos como usted quiere cargar sólo 20 microlitros, 30 micro litro entonces el gel de 1mm es lo suficientemente bueno. Pero si usted tiene volúmenes extendidos como 70 micro litros, usted puede usar 1,5mm, usted tiene que arreglar como este compartir placas en esto. Y los fondos deben ser iguales, entonces tenemos que poner en esta esta bandeja. Entonces vamos a mantener esto, por lo que tenemos que comprobar si configuramos perfectamente este, entonces no debería haber ninguna fuga. Pero si hay alguna fuga que está resolviendo el gel puede filtrarse y usted no conseguirá nada. Por lo tanto, en ese caso tenemos que comprobarlo antes de verter el gel. Por lo tanto, si está bien o no, por lo que voy a utilizar el agua de leche de leche justo después de comprobar el gel si hay fugas o no. Por lo tanto, hemos avanzado en la preparación de la resolución de gel, por lo que la competencia se da en esta diapositiva, por favor pasar por esa diapositiva. Esto es sólo agua, primero uso agua voy a añadir secuencialmente 4 ml de agua. Ahora, cómo añadir 3,3 ml de ya preparado el 30% de la acrilamida. Ya en la introducción, expliqué cuánto porcentaje tenemos que preparar y cuántas cantidades de acrilamida y bis-acrilamida necesitan tomar. Por lo tanto, aquí tenemos que añadir 3,3 ml de solución de acrilamida 30%, por lo que tengo que ajustar el micro de 300 litros. El siguiente componente es 1.5 molar Tris pH 8.8, tenemos que añadir 2,5 ml, el siguiente componente es SDS. Aquí SDS juega como doble papel, como una cosa es que da carga negativa, carga negativa cruzada en la cadena de polipéptido. El siguiente componente que tenemos que añadir es SDS, 10% SDS tenemos que añadir 100 micro litros de SDS a reservar gel. Juega un papel muy crucial en la electroforesis en gel de poliacrilamida. Al igual que imparte carga negativa y la cadena polipeptídica, por lo que a pesar de su cargo se moverán en función del peso molecular. Por lo tanto, voy a añadir SDS, lo otro importante es que el 10% de amonio por sulfato, amonio por sulfato que es catalizado por TEMED proporciona especies radicales libres que aceleran la malla agrícola como forma en gel de acrilamida como que catalizará la formación de la malla. Así que este es el 10% de APS, acabo de añadir 100 micro litros de 10% APS para resolver gel. En último paso tenemos que añadir TEMED, TEMED tras añadir todos los componentes al final del gel, tenemos que añadir TEMED. Porque si se agrega antes se facilitará rápidamente la polimerización, por lo que no se puede sacar con la pipeta. Por lo tanto, se solidifica por completo, por lo que es por eso que hay que añadir al final del gel de resolución. Así que, a mí me voy a añadir 5 micro litros de este TEMED que catalyses el amonio por sulfato, amonio por sulfato que a su vez proporciona especies radicales libres y especies radicales libres acelerar la polimerización, este es el principio general de (()) (40:53). Así que, añadiré, tenemos que mezclar correctamente y luego añadir lentamente un rincón, por lo que después de esto tenemos que superarlo en la capa superior tenemos que recubrir algún disolvente como el 2-butanol o isopropanol o con agua. Así que, por qué estamos haciendo esto, porque si el gel está expuesto al aire entonces el oxígeno del aire interferirá en la polimerización del gel, por lo que tenemos que añadir agua de witer o 2-butanol para este fin. Ahora tenemos que comprobar si está solidificado o no, por lo que se solidifica, ahora tenemos que quitar la capa sobrepuesta como que hemos usado el agua. Por lo tanto, no es necesario eliminar, si usted está usando isopropanol o butanol tiene que eliminar eso y lavar con el agua de leche de leche. Así, ahora empezaremos a preparar el gel de apilamiento, las composiciones se dan en el vídeo, hay que añadir 3,4 ml de agua primero. Siguiente lay 30 micro litro de acrilamida, 630 micro litros de Tris HCL pH 6.8, 50 micro litros de TEMED y 50 micro litros de SDS que tenemos a un